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常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本 技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因 突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室 度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待 测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组 DNA 和细胞总 RNA。核酸 探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互 补的已知 DNA 或 RNA 片段。根据其来源和性质可分为 cDNA 探针、基因组探针、寡核苷酸 探针、RNA 探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization ）是将变性的 DNA 固定于固体基质（硝酸纤维素膜或 尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization ） 是道先将被测的 DNA 或 RNA 变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的 DNA 或 RNA 探 针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品， 可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷 贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假 阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern 印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的 DNA 片段，将凝胶上的 DNA 变性并 在原位将单链 DNA 片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对 应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子 的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及 限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern 印迹杂交:由Southerm 印杂交法演变而来，其被测样品是 RNA。经甲醛或聚乙二 醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定 mRNA 分子 的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。 差异杂交（differential hybridization ） 是将基因组文库的重组噬菌体 DNA 转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同 cDNA 探针 （如：转移性和非转移性癌组织的mRNA 逆转录后的 cDNA ）分别与滤膜上的 DNA 杂交， 分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生 物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人）， 则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅 5％左右），价值不大。 cDNA 微点隈杂交（cDNA microarray hybridization ） 是指将 cDNA 克隆或 cDNA 的 PCR 产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上（如： 尼龙膜或活化的载玻片）以微点阵，然后用混合的不同 DNA 探针与微点阵上的 DNA 进行杂 交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交 技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服 保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。 寡核苷酸微点隈杂交（oligonucleotide microarray hybridization ） 是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共价结合于支持物表面，与平均长度为 20-50nt 的混合 RNA 或 cDNA 探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显 微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度 mRNA 的检测，以区分基因家族不 同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较 大、成本较高、速度较慢等弱点。 液相杂交（solution hbridization ） 指使变性的待测核酸单链与放射笥核素标记的已知的酸单链（探针）在溶液中保温，使之形 成杂交复合物。反应结束后，用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开，然 后结膈后在杂妆分子中的探针量，就可推算出被测的核酸量。 递减杂交（subtractive hybridizatio ） 是利用两种来源一致而功能不同的组织细胞提取 mRNA （或逆转录成的cDNA ）,在一定的条 件下以过量的驱动 mRN