细菌基因提取裂解液.pdf

核酸的提取与纯化 一 DNA 的提取与纯化 （一） 实验目的与主要原理 DNA 存在于细胞核中。通过裂解组织与细胞，使细胞膜破 碎，暴露出 DNA 与蛋白质的混合物。此时，通过蛋白酶的消化， 使 DNA 与蛋白质进行分离，而后利用硅胶柱或者酚：氯仿法，去 除蛋白质，从而提取高纯度 DNA。 （二） 实验材料 蛋 白 质 K （ 20mg/ml） ,裂 解 液 （ 100mmol/l Tris(pH 8.0),500mmol/L EDTA(pH 8.0),20mmol/l NaCl,10% SDS）,硅胶柱， TE （ 10mmol/l Tris-HCl,1mmol/L EDTA(pH 8.0),0.5*TAE (20mmol/l Tris- 乙 酸 ， 0.5mmol/l EDTA,pH 8.0),10*Loading buffer(50mmol/l EDTA,60%甘油，0.25%溴酚蓝，pH 7.0) 。 （三） 实验方法 DNA 提取的方法目前主要有两种，一种是利用酚：氯仿抽提的方 法，另一种是利用硅胶柱吸附的方法。其中酚：氯仿抽提法由于试剂具 有较强的腐蚀性和毒性，且对环境污染较大, 目前使用者较少。而硅胶 柱的方法操作比较简单，且毒性很低，对环境的影响较少，故而被广 大实验者所使用。目前硅胶柱的生产厂家较多，以沉淀方法较为多见， 主要步骤如下。 1 样本前处理 哺乳 物细胞：提前准备 55℃冰浴。 （1） 对于贴壁细胞，用胰蛋白酶或其他方法收集细胞， 对于悬浮细胞，直接收集细胞。用 PBS 洗 3 次。 （2） 加入 3 倍体积的裂解液，加入蛋白液 K 终浓度达 到 500ug/ml，37℃孵育 4~6 小时。 物组织：提前准备 55℃，70℃水浴。 （1） 将 25mg 物组织切碎，置于一无菌的 1.5ml 离 心管中（注意，尽量越碎越好）。 （2） 加入 150~200ul 的裂解液（含 500ug/ml 的蛋白酶 K），55℃孵育直至完全裂解，（因组织不同而异，鼠尾 6~8h,可以过夜裂解，每小时颠倒 2~3 次）。 （3） 如果需要去除RNA，可以加入适量Rnase A 于样 品中，室温孵育 2min。 （4） 12000r 离心 5min，转移上清于一无菌的离心管。 2 DNA 提取过程 （1） 利用 2 倍体积无水乙醇和 1/10 体积的 3mmol/L 醋酸钠沉淀 DNA （注意沉淀为 DNA，不能弃去） （2） 将上述混合物加入硅胶柱中，12000r 离心 1min， 后用 75%的乙醇清洗杂质，洗 2~3 次。 （3） 将硅胶吸附柱置于干净的离心管中，在柱的中央 加入 200ul 预热 TE （60℃），或去离子水（pH）7.0），室温静 置 1min，12000r 离心 1min，洗脱ＤＮＡ。洗脱出的ＤＮＡ置 于－２０℃保存。 　　　　3 琼脂糖凝胶 电泳 （1）1%琼脂糖的配制：例如：0.15g 琼脂 糖+15ml 0.5*TAE 微波炉加热至沸腾，待降低至 70℃ 加入 Gold view 染料（5ug/100ml），倒入小型胶槽中（其 他规模胶槽按此比例配制）。室温静置 40min。 （2）取 50~100ng DNA,用去离子水补充体积至 10ul，