淋巴细胞表面抗原检测20141113硕士班8讲义资料.pptVIP

;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;T细胞表面标志及其亚群;T细胞表面标志及其亚群;*;*;*;;流式细胞术检测样本;流式细胞术检测指标;细胞结构 细胞大小 细胞粒度 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 染色体分析;流式细胞仪组成;*;*;光学系统;光学系统;悬浮状态的细胞 单个流过流动室 细胞被激发 产生散射光和荧光 信号 信号被采集 转换成数字信号 存储于电脑上;前向散射光 forward angle light scatter FALS、FSC、FS 光学检测器在入射光的正前方所收集的低角度光信??,与细胞或颗粒的大小和体积有关。 侧向散射光 side scatter, SSC 光学检测器在入射光的直角处所收集的细胞散射的光信号,与细胞或颗粒的内部和表面结构复杂程度有关,如细胞质颗粒性、膜不规则性及核形等。;荧光强度 fluorescence intensity 结合到细胞或颗粒上的荧光素的量。荧光信号的通道数越大提示荧光强度越强。在恰当的条件下,荧光强度与一个细胞和特定荧光素相结合的位点数相关。 自发荧光 autofIuorescence 未染色细胞白身发出的荧光。通常由嘧啶和黄素核苷酸所产生,自发荧光的强度取决于激发光的波长,且随所分析细胞的类型和(或)细胞活化状态而改变。通过特殊的标本处理方法可以降低自发荧光的强度(如用结晶紫孵育)。;颜色补偿 coIor compensation 由于一种荧光素发射的荧光叠加到其他荧光素发射的波长范围内而造成荧光信号重叠，通过在其他荧光信号中扣除已测定荧光信号的一部分而纠正颜色重叠造成的计数错误。扣除的荧光量是用恰当的单染对照来确定的。被校正的信号反映了单荧光信号的发射情况。 设门 gate 在流式细胞仪显示的象限图上基于一组参数(如荧光对SSC、FSC/SSC等)来确定的所要分析的目的细胞群。对限定区内的目的细胞群通过其他参数(如荧光参数)进一步分析其表达情况。;数据采集;当使用激光光源时，在前向方向（和激光行进的方向相同）上可用前向散射光接收通道接收到一定量的散射光 前向散射光的强度是和细胞或其他检测颗粒的大小、形状密切相关的;当激光光源被使用时，侧向也有一定量的散射光产生， 可以用90o 角的侧向散射光检测通道来采集 侧向散射光的强度和细胞或其他检测颗粒的颗粒密度、内部复杂程度密切相关;外周全血细胞散射光双参数点图; 细胞标记上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长的激发光来激发，同时发出特定波长的光 荧光物质被激发以后产生的发射光将由特定的荧光通道来接收 特定检测是通过光学滤片和透镜来控制的;数据采集;电压;阈值;补偿;数据分析;直方图;散点图;等高线图和密度图;三维图;统计数据;数据获取与分析;荧光素标记的单克隆抗体 采用荧光素直接标记的单克隆抗体(单抗)，称直标抗体。选择直标抗体是淋巴细胞亚群分析的关键步骤,要考虑所选抗体对细胞的反应性。 单抗 CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56。;*;单抗对淋巴细胞亚群的鉴定 CD4、CD8、CD16和CD56单抗均不能特异性标记淋巴细胞某一亚群。 采用CD45和(或)CD3作为设门抗体,同时兼做质控试剂。 CD3+ T细胞标记为CD3 +, CD4+T细胞标记为CD3 + CD4+ CD8+ T细胞标记为CD3+ CD8+ B细胞标记为CD3 -CD19 + NK细胞标记为CD3 - CD56+ 或 CD3 ˉ CD(16+56)+ ;直标抗体常用荧光染料 异硫氰酸荧光素(FITC) 藻红蛋白(PE/RD1) 藻红蛋白偶联物(PECY5) 多甲藻叶绿素蛋白(PerCP) 藻红蛋白-德州红偶联物(ECD) 别藻青蛋白(APC) 除别藻青蛋白(APC)外,其他荧光染料均采用488nm的激发光源激发,最大发射波长分别为525nm、575nm、670nm、675nm和613nm。 别藻青蛋白(APC)的激发光源为630nm,最大发射波长为660nm。;溶血素 使用与仪器相匹配的溶血素(内含固定液),并严格按照使用说明和注意事项进行操作。如果使用没有固定作用的溶血剂(如氯化铵和低渗缓冲液等),染色后标本需要保存在4℃ ,并在1h内完成上机 固定液 0.1%-2.0%多聚甲醛或甲醛缓冲液是常用的固定液,用于对感染的标本在分析前进行灭活,能够灭活HIV 等病毒的3个-5个对数级的病毒载量。在染色过程中的最后一次离心后,用含有多