第五章蛋白质结构分析技术2复习课程.pptVIP

第五章 结构分析;蛋白质的氨基酸序列分析 生物质谱 X-射线晶体衍射技术 核磁共振 溶液中蛋白质分子构象的研究方法 蛋白质组 ;第一节 蛋白质和多肽的 氨基酸序列分析;It works by cleaving the N-terminal AA off and leaving the rest of the peptide intact. The Edman method can be repeated on the peptide remaining after the reaction, so this is a very effective method for obtaining AA sequence information. In fact the whole sequence of a peptide containing many AAs can be determined by Edman method. ;降解反应分三步 偶联 PITC的异硫氰酸酯基与蛋白的自由?－氨基作用，产生苯氨基硫甲酰蛋白质。 裂解 PTC－蛋白质在无水条件下酸裂解，切下反应的那个残基，暴露出下一个自由?－氨基。 转化 ATZ－氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液条件下，转化成稳定的PTH－氨基酸。 PTH－氨基酸的鉴定 薄层层析，HPLC, GC(气相色谱），质谱分析等。;;;蛋白质N端测序仪器分析法： 1. 液相旋转杯序列仪 最早，很少用 2. 固相序列分析仪 有些氨基酸不能正确测定 3. 气相顺序仪 灵敏度很高，降低费用 4. 新型蛋白测序仪 快速可靠，高自动化 ;二. C端序列分析 适用 1. 鉴定重组蛋白是否正确表达 2. 大规模生产时质量控制 3. N端封闭蛋白的分析 4. DNA探针的设计 原理 化学试剂与蛋白质和多肽的羧基反应， 反应后的C末端衍生物被切割下来，通 过HPLC系统进行分析。;步骤 活化 酰胺化保护侧链羧基 烷基化 修饰Thr和Ser的羟基 裂解和衍生;Protein-COOH;第二节 生物质谱技术;MALDI – MS 电离基本原理： 将分析物分散在基质分子中并形成晶体。激光照射晶体时，使基质晶体升华，基质和分析物膨胀并进入气相。 The MALDI instrument is a matrix assisted laser desorption ionisation - time-of-flight （TOF) mass spectrometer，specifically for high throughput mass mapping of peptide digest fragments originating from proteins excised from 2D-gels i.e. proteomics. ;MALDI离子源 电离技术的关键----基质的使用 基质的作用：样品离子形成过程中充当 质子化或去质子化试剂，使样品分子带 上正电荷或负电荷。 常用基质： SA(芥子酸） DHB(龙胆酸） CCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸） ;2. 质量检测器 1） 线性分析时间检测器（TOF) 优点：质量分析范围100Da~100kDa 不足：分辨率和测量准确度低 2）反射分析时间检测器（RETOF) 分析质量数10kDa以下的离子 3. 样品制备 ;;二. ESI – MS 电离方法：靠强的电场使分子电离。分析 物溶液流经一个细细的进样针，针头上加 高电压用来产生正离子。高电压导致样品 液流分散为呈喷雾状的带电荷的微小滴。 当液滴从针尖通往入口时，在定向惰性气 体流作用下，溶剂蒸发，液滴缩小，电荷 密度增加，最终液滴爆裂，离子从液相中 释放出来进入气相。 ESI – MS 优势：可与多种分离技术联合 使用，如LC – MS, HPLC – MS 等。 ;It is operated with electrospray ionisation and samples can be introduced into the mass spectrometer by a number of different techniques. ;The Q-Tof is a tandem mass spectrometer (MS/MS) with t