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Engineered Saccharomyces cerevisiae that produces 1,3-propanediol from D- glucose 工程化啤酒酵母细胞利用 D- 葡萄糖生产 1,3- 丙二醇 文献查找：张帆 文献翻译：曾熙、朱悦、张帆 PPT 整理及展示：张艳丽（组长） 二、背景 三、实验方法 一、摘要 四、实验结果 摘要 ? 在发酵产业中啤酒酵母是一种安全的微生物。 1,3- 丙二醇是一种广泛 用于聚合物生产的重要化学原料，但是由于化学合成成本昂贵，它的 实用性受到限制。本研究的目的就是利用工程化啤酒酵母低成本生产 1,3- 丙二醇。 ? 啤酒酵母利用 D- 葡萄糖作为原料，能够生产丙三醇，而不是 1.3- 丙二 醇。在本研究中，我们克隆了两个基因 yqhD 和 dahB ，这两个基因可以 使丙三醇转化成 1,3- 丙二醇，把这两个基因通过农杆菌转化实验整合 到啤酒酵母的 W303-1A 染色体上。这个工程化的啤酒酵母通过功能性 yqhD 和 dhaB 基因来实现 D- 葡萄糖到 1,3- 丙二醇的生产。 ? 据了解，该研究在 1,3- 丙二醇生产产业中是一种安全的、低成本的方 法。 背景 背景 使用与成 本的矛盾 降低成本 化学合成 发酵 背景 ? 克雷伯肺炎菌：在克雷伯肺炎菌中，参与 1,3- 丙 二醇的生物合成的基因是 dhaB 和 dhaT 。 DhaB 是一 种依赖维生素 B12 的脱水酶，它转化丙三醇到 3- 羟 基丙醛，而 DhaT 是一种依赖 NADH 的氧化还原酶， 它可以转化 3- 羟基丙醛到 1,3- 丙二醇。 ? 大肠杆菌：大肠杆菌能利用 D- 葡萄糖生产丙三醇 ，可以通过把 dhaB 和 dhaT 基因整合到大肠杆菌来 生产 1,3- 丙二醇，但是 DhaT 活性过低，导致收率 低。 yqhD 基因的发现解决了这一问题。 背景 ? 克雷伯肺炎菌的生产原料是丙三醇，价格昂贵。 ? 大肠杆菌产生内毒素，可能引起疾病。 ? 啤酒酵母已经用于发酵产业好多年了，主要是由 于它使用 D- 葡萄糖这种低成本原料作为碳源和能 源。 ? 野生型啤酒酵母只产生丙三醇，但没有产生 1,3- 丙二醇的能力。 背景 实验方法 一、材料： PCR 试剂、限制酶、小牛碱性磷酸酶、 凝胶提取盒、尼龙膜等 二、培养基和生长条件 实验方法 四种培养基 ： 发酵条件：有氧环境、摇床250rev/min30℃。 LB 培养基 YPD 培养基 B 培养基 CM 培养基 实验方法 用于这项研究的菌株、质粒和引物： 实验方法 ? DNA 片段的 PCR 扩增 ? 分别构建包含 yqhD 基因的 pZR1 质粒和 dahB 基因的 pZR2 质粒 ? 分别构建包含 yqhD 基因的 pZR1 质粒和 dahB 基因的 pZR2 质粒 ? 土壤农杆菌介导的转化 ? 啤酒酵母染色体上的 yqhD 和 dhaB 基因的 PCR 与印迹 杂交分析 ? 气相色谱法测定 1,3- 丙二醇 实验方法 分别构建包含 yqhD 基因 的 pZR1 质粒和 dahB 基因 的 pZR2 质粒；构建 pZR3 质粒；构建包含 yqhD 和 dhaB 基因的质粒 pZR4 实验方法 土壤农杆菌介导的转化 在本研究通过农杆菌介导的转化方法将 yqhD 基因和 dhaB 基因整合到啤酒酵母的染 色体上。 第一步，质粒 pZR4 通过电穿孔转染到农杆菌 LBA4404 ，形成 LBA4404-ZR4. 农杆菌 LBA4404-ZR4 在含有博来霉素的 B 培养基上培养过夜，收菌，在 B 培养基上重悬培 养（含或不含 100umol/l 乙酰丁香酮），生长到 1x1011cell ml-1 ，再孵化培养 6h 。 与此同时，啤酒酵母 W303-1 在摇床30℃下培养过夜，稀释 20 倍到新鲜的 YPD 培养 基上，培养 6h 。细胞通过离心收集，用不含乙酰丁香酮的 B 培养基清洗，然后重 悬，接种到相同培养基上，最后生长到 1x10