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实验五：血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳（验证性； 4 学时） 【实验目的 】 1. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。 2. 熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作过程。 3. 了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点和应用范围。 【实验原理】 1．聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理 聚丙烯酰胺凝胶 (PAG)是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰 胺（Acrylamide 简写为 Acr ）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（ N，N1-methylene-bisacrylamide ， 简写 Bis ）在催化剂 （过硫酸胺或核黄素） 的作用下， 聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链， 相邻的两个链通过甲叉桥交联形成就具有三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。为了加速聚合， 在合成凝胶时还加入四甲基乙二胺作为加速剂。 聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构， 能起分子筛作用。 用它作电泳支持物， 对样品的分 离不仅取决于各组分所带电荷的多少， 也与分子大小有关。 凝胶网孔的大小主要受成胶物的 总浓度及 Acr 和 Bis 的比例的影响。一般电泳采用成胶物质总浓度为 7.5%，此浓度称为标 准凝胶浓度。如果改变总胶浓度，也应相应改变 Acr 和 Bis 的比例。 2．不连续聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的原理 根据凝胶各部分缓冲液的种类及 pH 值，孔径 大小是否相同等，可分为连续系统和不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE）。连续系统是 指电泳槽内缓冲液的 pH 值与凝胶中的相同，不连续系统则不同。 不连续圆盘电泳一般是在小玻璃管内进行的。 把三种性质不完全一样的聚丙烯酰胺凝胶 重叠起来。上层为样品胶， 中间为浓缩胶， 这两层胶的凝胶浓度为 3%是大孔胶，应用 Tris-HCl 缓冲液，其 pH6.7 。下层是分离胶，此层凝胶总浓度为 7.5%，是小孔胶，也用 Tris-HCl 缓 1 冲液， pH8.9 。上下电泳槽缓冲液是 Tris- 甘氨酸缓冲液， pH=8.3 。由于凝胶的孔径和缓冲 液的 pH 值不同，产生浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，使电泳的灵敏度、分辨率提高。 （1）浓缩效应：无论哪种电泳方式，要想得到良好的分离效果，电泳开始前必须使样 品中各种成分同处于同一起跑线上。 样品加入后颗粒分散， 不能从同一起点开始电泳， 但样 品通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层， 使颗粒同时开始电泳。 其机理是样品胶及浓缩胶 的 Tris-HCl 缓冲液 pH=6.7 ，电泳时， HCl 全部电离为 Cl - ，而电泳槽内 Tris- 甘氨酸缓冲液 pH=8.3 ，甘氨酸等电点 pI=6.0 ，电泳时，甘氨酸仅极少部分电离为甘氨酸负离子（ Gly - ）， - 一般血清蛋白质点约 pI=5.0 ，也解离为蛋白质负离子（ Pr ），其解离度比 HCl 小，比甘氨 酸大。通电后，这三种离子同时向正极泳动，有效泳动率是 Cl - ＞ Pr- ＞Gly - ，电泳时开始 - - - 时， Cl 泳动最快（称快离子），很快超过 Pr ，泳动到最前面， Gly 泳动最慢（称慢离子）， - 泳动到最后， Pr 介于其间，被浓缩成一个狭小的样品薄层。这种浓缩作