实时荧光定量PCR实验结果分析共31页.ppt

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实时荧光定量 PCR 实验结果 分析 邓椋爻 技术支持 广州市昊洋贸易有限公司 ? 定量分析 ? 绝对定量 ? 相对定量 定量 PCR 应用 ? 定性分析 ? SNP 分析,基因扫描 ? 阴阳性判定 ? 熔解曲线分析 绝对定量: How Many – 优点: 给出目标基因初始模板的 绝对数量,数据容易处理 – 缺点: 必须有标准品,做标准曲 线 – 应用: 病毒拷贝数;转基因的拷 贝数;转基因成分百分含量检测 绝对定量与相对定量 相对定量 :How Much – 优点: 需要 / 不需要标准品;使 用广泛 – 缺点: 数据理解困难 – 应用: 差异表达分析;芯片评 估 14500 copies 0 0.5 1 1.5 2 2.5 N orm al T reatm ent A T reatm ent B 10 8 10 6 10 2 10 4 绝对定量 10 8 10 6 10 2 10 4 T 绝对定量 绝对定量 10 8 10 6 10 2 10 4 T 绝对定量 10 5 copies/well 绝对定量 1/3 Blank 1/3 1/3 1/3 1.11 ng/2ul 0.37 ng/2ul 0.12 ng/2ul 10.0 ng/2ul 3.33 ng/2ul 相对定量 T Control C T = 21.3 Sample A C T = 22.8 Sample B C T = 19.3 相对定量 Control C T = 21.3 = 1.5ng / tube ? 1 Sample A C T = 22.8 = 0.5ng / tube ? 0.33 Sample B C T = 19.3 = 6.0ng / tube ? 4 F o l d 相对定量 相对定量数据处理 ? 管家基因校准 (Normalization Gene) – 得出每个细胞中的 [ 目的基因 ] – 目标基因 vs. 管家基因 ? 对照样品校准 (Calibrator Sample) – 得出相对于某个样品的基因表达量 , 1X sample. – 处理的 vs. 未处理的, 6hr vs. 0 hr, 病理 vs. 正常 … . 目标基因 管家基因 处理后 处理前 ERBB2 GAPDH Sample Calibrato r ? 按比例稀释标准品,根据标准曲线确定样本初始模板浓度 ? 至少需要两个标准曲线 ? GOI ? ≥ reference gene ? 标准曲线确定反应扩增效率 相 对 定量 —— 标 准曲 线 相对定量 相对定量: ?? CT 法 ?依据:平均相对含量 % = 2 – 平均 Δ Δ CT ?数据处理: △ C ( t ) GOI - △ C ( t ) ref = △ C ( t ) △ C ( t ) sample- △ C ( t ) calibrator = △ △ C ( t ) ?好处:不做标准曲线 ?应用范围: 扩增效率较高,目标基因和内标基因扩增效率一 致并且相互独立扩增;不做标准曲线,高通量检测(芯片评估) ;不要求很高的精度 应用实例 - 基因表达分析 利用 TaqMan 技 术 研究 ERBB2 在乳腺 肿 瘤 组织标 本中的表达差异 实验设计流程 RNA 提取 RT-qPCR 实验 结 果分析 RNA 定量 反 转录 (RT) 设计 qPCR 实验 方法 Aurum Total RNA kit iScript cDNA Synthesis Kit 材料和方法 ? 已知在 50% 的乳腺肿瘤样本中, ERBB2 表达异常, 因此可以作为一个检测标准 ? 选用 GAPDH 作为内标基因 - FAM 标记的 ERBB2 探针 - VIC 标记的 GAPDH 探针 ? 标准品(质粒)构造标准曲线 ? 多重 PCR 反应 ? 阴性对照 -无 RNA 对照(空白) -无逆转录酶对照(监

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