细胞核与的线粒体分离.ppt

实验十二、细胞核与线粒体的分级分离 (差速离心法与密度梯度离心) 、实验目的: 初步了解细胞内各种成分的分离方法; 、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法 3、对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。 、实验原理 细胞器分离基本步骤 细胞破碎 分离、纯化——细胞器鉴定 (一)细胞破碎的方法 1.杆状玻璃匀浆器法 2.高速组织捣碎机法 3.超声波处理法 4.化学裂解法 5.反复冻融法 细胞破碎的注意事项: 1、匀浆介质:常用介质是缓冲的蔗糖水溶液 (0.25mol/L)。它比较接近细胞质的分散相,具有 足够渗透压,防止颗粒膨胀破裂,对酶活性干扰小, 在pH72-74的条件下细胞器不易发生聚集 、尽可能在低温条件下进行,避免酶失活。 3、若是采用低渗方式破碎细胞,匀浆物在低渗溶液中 的时间要越短越好,通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长 导致细胞器破裂,溶酶体酶泄漏,各种物质降解。 、实验原理 (二)分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异,离心 成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮 力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。 主要包括差速离心、密度梯度离心等方法 差速离心法 Differential centrifugation) 根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别 分级增加离心力,从试样中依次分离出不同组分的方 法。从低速到高速逐级沉淀分离,一般用于分离沉降 系数相差较大(10倍及以上)的颗粒。