蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE.ppt

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聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 分离血 清蛋白质 1 强化学生对电泳基本原理的理解与记忆。 2 熟记聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的 基本原理、学会操作。 实验目的 电泳原理 带有电荷的颗粒在电场中泳动的现象叫电泳。带 正电荷的泳向负极,带负电的泳向正极。 许多生物分子都带有电荷,其电荷的多少取决于 分子性质及其所在介质的 pH 及其组成。 因此,在一定时间内,由于各组分移动距离的不 同,而达到分离鉴定各组分的目的。 影响电泳速度的因素: ? 样品本身:带电量,分子大小,形状 ? 电场强度:电压 ? 电泳介质的 pH 和离子强度 ? 一般来说,带电越多,分子量(颗粒)越小而 且是球形的,则泳动速度就快。反之,则慢。 蛋白质 N 端游离氨基, C 端游离羧基以及侧链上 一些基团在一定 pH 条件带电荷, 因此可以用 电泳技术分离和鉴定。 COO- COO- COOH ╱ + H + ╱ + H + ╱ Pr ← ———— → Pr ← ———— → Pr ╲ + OH- ╲ + OH- ╲ NH 2 NH 3 + NH 3 + PH>PI PH=PI PH<PI 聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE) 是一种人工 合成的凝胶,它是由丙烯酰胺 (Acr) 和交联剂亚甲基双丙烯酰胺 (Bis) 在 催化剂作用下,聚合交联而成的含 有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合 物。 聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE) ? 丙稀酰胺(单体)+ N,N- 甲叉双丙稀酰胺(交 联剂) → (催化剂) → 聚合 ? 催化剂:过硫酸铵 AP +四甲基乙二胺 ( TEMED ) ? 改变单体和交联剂浓度可改变凝胶孔径 聚丙烯酰胺凝 胶电泳分为连 续系统与不连 续系统两类。 圆盘电泳和板 状电泳原理相 同。 PAGE 垂直板电泳示意图 物理效应 浓缩效应: 1 )凝胶层的不连续性 两层凝胶 T 与 C 不同 ? 孔径不同 浓缩胶孔径大,分离胶孔径小,蛋白质在大 孔径浓缩胶中移动,受阻力小,移动速度快。 2 )缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸 ( pI=6.0 )在 pH8.3 带负电,朝正极移 动,进入浓缩胶( pH6.7 ),甘氨酸解离度 ( ? )很小,有效迁移率( M ? )很低,移 动速度较慢,称为 慢离子 。 浓缩胶中 HCl 是强电解质, ? =1 , Cl - 有效迁 移率大,移动速度快,称 快离子 。 蛋白质 ( pI < 6.0 )带负电荷, 有效迁移率介 于两者之间。 pH8.3 Tris- 甘氨酸缓冲液 甘氨酸 HCl 蛋白质 样品胶 浓缩胶 分离胶 样品 低 电 导 区 ? 分子筛效应: 分子量或分子大小和形状不同的 蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度 不同而表现出不同的迁移率,这就是分子筛效 应。当样品进入分离胶,凝胶孔径变小,分子 量小,阻力小,移动快;分子量大,阻力大, 移动慢。 ? 电荷效应: 电荷量不同,迁移率不同。 实验器材 ? 垂直板电泳装置 ? 电泳仪 ? 制胶架 ? 移液枪 ? 移液管 ? 烧杯 ? 培养皿 ? 离心机 操作方法 制胶 处理血清样品 注入电泳缓冲液 上样 电泳 染色和脱色 制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液,用细长头的滴管加至长、短玻璃 板间的窄缝内,加胶高度距样品模板梳齿下缘约 1 cm 。用 1 mL 注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层蒸水 ( 约 3 – 4 mm) , 用于隔绝空气,使胶面平整。 约 30-60 min 凝胶完全聚合,则 可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。 将上、下贮槽的蒸馏水倒去 ,将混合均匀后的浓缩胶溶液, 用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内 ( 即分离胶上方 ) , 距短玻璃上缘 0.5 cm 处,轻轻加入样品槽模板 . 在上、下贮槽 中加入蒸馏水,但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽, 10 min 左右,上胶即可聚合。 制备凝

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