免疫固定电泳操作规程.规范.docVIP

免疫固定电泳操作规程 一．项目名称 免疫固定电泳 (Ｈ YDRAGEL ＩＭ M Ｕ NOＦＩ XAT ＩＯ N) 二．检验方法名称 琼脂糖凝胶免疫固定电泳 三．方法学原理 血清蛋白电泳中出现得异常条带主要存在于β -球蛋白与γ -球蛋白区域 ,通常疑为单克隆 蛋白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异常条带 ,可运用免疫固定技术。免疫固定电泳就是 一种简单得技术 ,电泳后得蛋白质与相应抗体形成复合物与被固定在相应得位置上 ,通过下列 四个步骤 : １。蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分离。 2.电泳后已分离得蛋白质被固定并产生免疫沉淀 :应用固定剂与抗血清加于凝胶表面得泳 道上 ,并让固定剂与抗血清在凝胶内渗透扩散。 3.使用吸水纸与清洗将未沉淀得蛋白质去除 ,已被沉淀得蛋白质贮留在凝胶内。 4、将蛋白质染色 ,并将这些免疫沉淀区带得位置与蛋白质经电泳后观察到得异常蛋白区带 进行比较。 为了精确识别单克隆区带 ,样品同时在六条泳道上进行测试。经电泳后 ,ＥLP 作为参考泳 道以显示电泳后得蛋白质。其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。通过它 (们 )与抗血清 ,γ (I ｇ Ｇ) 、α (IgＡ )、μ (IgM) 重链与κ、λ轻链 (游离与非游离 )反应与否进行鉴别。该技术简单、 快速、图象清晰 ,易于解释结果、 四．方法学溯源 自１ 930 年由Ｔ iseｌ ius 发现了移界电泳 (moｖ ing bｏ undaｒ y eｅｃ trｏpｈ oresis),而 后,这种技术得各种局限性已逐渐被区带电泳 (zoｎ e ｅ lecｒ rｏｐ horesis)所克服 ,区带电泳得 条件与支持介质得选择就是电泳成败得关键、 通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性 就是鉴定某一蛋白成分最好得方法 ,免疫固定电泳技术就是目前应用最广泛得方法之一。 五．仪器 （一） 型号 :SEＢ IA ＨYD Ｒ ASY Ｓ (Ｐ N1210) （二） 分析与计算参数 : 1． 处理量 :约 18 个样本 /小时 2． 所需样本量 :１０ ul 3． 检验时间 :约 55 分钟 4． 重复性 :有良好得批内与批间重复性 5． 电泳参数 :电压 0-30０ V( 可选至 30０ 0V) 电流 0－ 500mＡ 功率０－１ 00W 六．试剂及配套品 （一） 试剂 1． HYD ＲＡ GＥL 1 IF 试剂盒 Ｈ Y ＤＲ AGE Ｌ ２ IF 试剂盒 HYDRAGEL 4 IF 试剂盒 HYDRA Ｇ EL 9 IF 试剂盒 1） 商标 :SEBIA 2） 包装规格 :1０测试／ 20 测试 /40 测试 /90 测试 （3） 货号 :PN43０ 1/ PＮ 43０2/ PN ４３ 0４ /PN43０ 9 2． 脱色液 商标 :SEBIA 包装规格 :Paｃｋ f ｏ r 10× 10０ｍ l 货号 :PＮ 454０ 成分 :柠檬酸 3。洗涤液 1） 商标 :SEBＩ A 2） 包装规格 :Paｃ k for 10 × 80ｍｌ 3） 货号 :PN4541 4） 成分 :叠氮钠 4、稀释剂 1） 商标 :SＥB Ｉ A 2） 包装规格 :Pａ ck fo ｒ 1× 5ml 3） 货号 :PN4５ 87 （二） 配套品 :ＩＦ试剂抗体 商标 :SEBIA (2 ) 包装规格 :Pack fo ｒ 5× 1ml (3) PN４ 3１５ 七．操作步骤㈠ 开机 ,启动电泳仪、 ㈡ 将 1 只(用于 1,２IF),2 只 (用于 4ＩF)或 3 只 (用于 9IＦ )点样梳置于整表面 ,有数字得一端向上 ,在 2 分钟内完成每块加样梳得加样 ,每孔加 1０ uｌ样品 ,然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内 5 分钟。 电泳 / 免疫固定泳道 孔号 ＥLP G A Ｍ K L Ｈydra ｓ yｓ １ IF 1 2 ３ ４ ５ 6 Hyｄ r ａ sys 2/4 Ｉ F 1 或 3 号样本 ２ 3 ４ 5 6 7 2 或 4 号样本 9 1０ 11 12 13 14 Hydras ｙ s 9 IF １ ,4 或 7 号样本 1 2 3 4 5 6 2,5 或 8 号样本 7 8 9 10 11 12 3,6 或 9 号样本 8 ㈢ 选择相应得“ IF" 电泳程序 , ㈣ 从包装袋内取出缓冲条 , 将其固定在电极支架背侧得钉上 , 再取出凝胶 , 用薄滤纸快速 轻轻地吸去凝胶表面多余得液体 ,在温控板表面下 1/3 处加 20０ｕ l 蒸馏水或去离子水 , 将 凝胶片底边紧靠框架底边 ,边缘对齐边线 , 略弯曲凝胶片慢慢放平 , 注意凝胶片下面勿出现 气泡、 ㈤ 自然放下支架 ,从湿盒中取出加样梳并去除齿梳下得保护支架 ,1、２Ｉ F