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（并购重组）第四章基因的 转移与重组体的筛选和鉴 定 第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定 第一节转化 基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。只有当 其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。在分子克隆实践中，在体外操作的核酸 分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。 一、重组 DNA 分子转入原核生物细胞 1.重组质粒DNA 分子转化大肠杆菌 转化（transformation）——重组质粒DNA 分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体 细胞内稳定维持和表达的过程。 转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等 低等真核生物受体细胞。 （1）CaCl 处理后的细菌转化或转染 2 A 、制备感受态细胞 受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl （50～100mmol／L）溶液处理后变成。 2 所谓感受态细胞 ，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA 的能力。 转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体 DNA 分子的生命过程； 转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体 DNA 分子的生命过程； 7 好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒 DNA 可得 5×10 个转化体。 B 、细胞转化（或转染）的具体操作过程： ①将处于对数期的新鲜培养物于 0℃4000 转/分离心 10 分，回收细菌细胞； ②将细胞用 0℃的 0.1mol/LCaCl 低渗溶液处理 30 分钟，离心回收细胞，再用适量 0℃的 2 0.1mol/LCaCl 重悬细胞，以诱导感受态产生。 2 ③加入适量 DNA ，于42℃热处理混合物 90 秒，使 DNA 分子被细胞吸收； ④将混合物快速转到冰浴中，冷却 1~2 分，加入适当的培养基，在 37℃培养 45 分，使细胞 复苏并表达质粒所携带的转化基因； ⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。 ⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。 （2）电穿孔转化法 基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation）， 形成可逆的瞬间通道，从而促进外源 DNA 的有效吸收。 受体细胞的准备：当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清 洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用 10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为 3×1010 个／ml ，分 装，在干冰上速冻后置于-70℃贮存。每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达 6 个月以 上。 （3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌 原理：是基于非接合型质粒的迁移作用（mobilization ）而建立的一种DNA 转化方式。 首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细 胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合 转化过程涉及到 3 种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒 DNA 的供 体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，故称三亲本杂交接合转化法。 2+ 尤其适用于那些难以采用Ca 诱导转化法或电穿孔法等进行重组质粒 DNA 分子直接转化的受 体菌。 （4）转化率的计算及其影响因素 转化率是指 DNA 分子转化受体菌获得转化子的效率 有两种表示方式： A ：以转化子数与用于转化处理的DNA 分子数或质量的比率表示 B ：以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。 以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算转化率 A ：通过菌液OD 值测定或细菌计数，计算出用于制备感受态细胞的受体菌总数。 B ：计算转化子与受体菌的比率。 用于制备感受体细胞的菌液每毫升有 5×107 个菌体，则 4ml 菌液有2×108 个菌体，由此菌液 制备成感受态细胞，通过转化处理，获得 1000 个转化子，则转化率 103／（2×108）＝ 5×10-6 。其含义是每个受体菌细胞被转化的概率 5×10-6 ，或者说，要得到一个转化子，需 要 2×105 个受体菌细胞。 每单位质量