完整版53血红蛋白的提取和分离.ppt

（二 ). 凝胶色谱操作 ---- 1. 凝胶色谱柱的制作： 2. 凝胶色谱柱的装填： 教材图 5 － 19 3. 样品的加入和洗脱 血红蛋白的纯化 材料： 交联葡聚糖凝胶 G-75 ； 20mmol/L 磷酸缓冲液 装填 : 2. 凝胶色谱柱的装填： 步骤 操作要求 ① ② ③ ④ ⑤ 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡 12h 洗涤平衡 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 装填悬浮液 凝胶颗粒＋洗脱液 → 沸水浴 凝胶颗粒＋蒸馏水 → 充分溶胀 根据色谱柱体积计算凝胶用量 色谱柱垂直固定在支架上 配制悬浮液 计算称量凝胶 固定色谱柱 3. 样品的加入和洗脱 ( 三） .SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳（选 做） 判断（ ）的蛋白质是否达到要求， 需要进行蛋白质的鉴定。 纯化 注意事项 1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2. 凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 3. 色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 4. 色谱柱成功标志： 红色区带均匀一致地移动。 为什么？ 三、操作提示 观察你处理的血液样品离心后是否分层 （见教科书图 5-18 ），如果分层不明显， 可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白 的原因。此外，离心速度过高和时间过 长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀， 也得不到纯净的红细胞，影响后续血红 蛋白的提取纯度。 四、 实验结果分析与评 价 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝 胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝 胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子 的有色物质，例如蓝色葡聚糖 — 2000 或红色葡 聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、 狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如 果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以 消除气泡，消除不了时要重新装柱。 2003 年 4 月 14 日宣布人类基因组序列图完成 这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代。 人类基因组：指 DNA 分子所携带的全部 遗传信息。 蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的 总和。主要是对蛋白质功能的研究 思考 1 分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有 不同物理或化学性质的生物大分子。 思考 2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的 形状和大小、所带电荷的性质和多少、 溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲 和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 思考 3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质 的何种作用，作用结果是什么被破坏？ 变性、变性、空间结构 （一） 凝胶色谱法（ 分配色谱法 ） 2. 凝胶： 大多数凝胶是由 多糖类化合物 （如葡聚糖或琼脂 糖）构成的微小多孔球体 ， 内部有许多贯穿的 通道。 根据被分离物质的 蛋白质相对分子质量的 大小， 利用具有网状结构的凝胶，来进行分 离。 1. 概念： 一、基础知识 3 、原理： 当不同的蛋白质通过凝胶时，相 对（ ）的蛋白质容易进入 凝胶内部的通道，路程（ ），移动速 度（ ），而（ ） 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能 在（ ）移动，路程（ ）， 移动速度（ ），相对分子质量不同 的蛋白质因此得以分离。 4 、具体过程 相对分子质量较小 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 1 、概念：在一定的范围内，能对抗 外来少量强酸、强碱 或稍加稀释不引起 溶液 PH 发生明显变化的作用叫做缓冲作 用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 2 、作用： 能够抵制（ ）对溶液的 （ ）的影响，维持 PH 基本不变。 外界的酸或碱 PH 值 （二）缓冲溶液 3 、缓冲溶液的配制 通常由（ ）种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的（ ） 就可以制得（ ）使用的 缓冲液。 1 － 2 使用比例 在不同 PH 范围内 思考：说出人体血液中缓冲对？ NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 H 2 CO 3 / NaHCO 3 1 、概念：指带电粒子在电场作用下发生 迁移的过程。 （三） 电泳： 2 、原理：许多重要的生物大分子，如 （ ）等都具有 ( ) 在 ( ) 下 ，这些基团会带上 （ ） 。在电场的作用下，这些 带电分子会向着与其（ ） 移动。 3 、本质：电泳利用了待分离样品中各 种分子 （ ） 以及分子本 身 （ ）、（ ） 的不同，使带 电分子产生不同的（ ），从而 实现样品中各种分子的分离。 多肽、核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 一定的 PH （ 1 ）聚丙稀酰胺凝胶：