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噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA作为载体的优点： l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达 外源基因 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA M13噬菌体的生物学特性： 生物结构 M13噬菌体的外型呈丝状 M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 DNA全长6407个核苷酸 M13 DNA上至少有10个基因 2700个外壳蛋白分子 M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA M13 DNA载体的特点： 使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外 这在DNA定向突变中非常有用 M13重组分子筛选简便 被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混 浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊 斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb 噬菌体或病毒DNA 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组DNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病 毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链DNA病毒 双链DNA病毒 单链RNA病毒 双链RNA病毒 RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物， 这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。 病毒载体： 一、Ca MV克隆载体 花椰菜花叶病毒组（CaMV） 特点：唯一以双链DNA做为遗传物质的植物病毒，共12种病毒。 在插入外源DNA厚会失去病毒感染性，不能直接感染植物。 二、烟草花叶病毒（TMV）克隆载体 单链RNA，6395bp 特点：复制量和外壳蛋白表达量高，寄主范围广，能在整株植物上快速扩散 常用作植物表达克隆载体 三、SV40克隆载体——哺乳动物基因克隆载体 （猿猴空泡病毒40） （一）SV40基因组 双链闭环DNA：5243bp （二）SV40-DNA复制与增殖 猿猴细胞——受纳细胞 嚙齿动物（小鼠、仓鼠）——非受纳细胞；细胞癌变 人：1～2%细胞产生病毒颗粒，不会插入染色体，相对安全 三、穿梭载体（shuttle vector） 带有原核和真核细胞的复制起始点 常将真核生物的克隆载体构建成穿梭载体，使其先在大肠杆菌中扩增，将目的基因与之构成合适的重组体后，再转入真核细胞 若加上适当的真核启动子等元件，则成为真核表达载体，能在真核细胞中表达插入载体中的外源基因 三、穿梭载体（shuttle vector） 真核系统载体还必需具备适当的筛选标记 一种筛选标记是，使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补（如TK基因产物）。 另一种普遍使用的是抗新霉素基因。因此，真核克隆载体的构成一般由来自噬菌体、质粒和病毒的DNA元件构建而成。 三、穿梭载体（shuttle vector） （二）逆转录病毒载体 （一）SV40（猿猴病毒）载体 （一）SV40（猿猴病毒）载体 真核表达载体中的调控元件大都来源于SV40的调控顺序和复制信号 用SV40作为载体有两种方式 用SV40 DNA与外源DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源DNA的病毒颗粒； 重组子不包装成病毒颗粒，而象质粒一样在细胞中复制或整合到染色体组中。 三、穿梭载体（shuttle vector） 例：PSVK3质粒 PSVK3是一类广泛适用于哺乳动物细胞系表达外源基因的穿梭载体。 三、穿梭载体（shuttle vector） PSVK3具有下列构件： 原核系统构件：①复制子和丝状噬菌体复制起始位点fl;②筛选标志（Ampr）；③启动子（T7启动子）。 真核系统构件：① SV40复制起始点；②SV40早期启动子 RNA修饰信号：①SV40小T抗原拼接信号；②SV40早期区mRNA polyA加尾信号。 多克隆位点：SV40启动子下游有8个酶切位点。 三、穿梭载体（shuttle vector） pSVK3质粒 （二）逆转录病毒载体  逆转录病毒载体具有几个特点 具有广泛的哺乳动物细胞宿主 较大的容量，能插入7kb大小甚至更大的外源基因 三、穿梭载体（shuttle vector） 常用的遗传标记基因 1) 氨苄青霉素抗性基因（Ampr） 2)四环素抗性基因（Tetr） Ampr抗性基因编码一种β-内酰胺酶，可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 五、载