生化 年研究生实验2 PCR检测apoB基因多态性.ppt

Mg 2+ (1)TaqDNA 聚合酶作用时需要 Mg 2+ (2) 不同的酶需不同 Mg 2+ (3) Taq ： Mg 2+ 对反应影响很大， 1-3 mM 终浓度 外界影响： (1) EDTA 鳌合 Mg 2+ 选较低浓度 TE(10mM Tris,1mM EDTA) ； (2) DNA 模板、引物和 dNTP 的磷酸基团均可与 Mg 2+ 结合， 降低 Mg 2+ 有效浓度 如果扩增产物或效率不理想，要注意调整 Mg 2+ 浓度 （三） PCR 反应条件 1. PCR 循环的温度和时间（变性、退火、延伸） 2. PCR 循环的次数和平台效应 （ 1 ） 变性温度 ： 94-95 ℃ Templete ： GC 比例高、长度很长，则变性时间 ↑ （ 2 ） 退火 ： 温度越高，扩增特异性越好 取决于引物 Tm 值： Tm 值 =4(G+C) ＋ 2(A+T) ； 复性温度 =Tm 值 -(5 ～ 10 ℃ ) ，一般在 45 ～ 55 ℃ ； Tm↑ 退火 T↑ ， Tm↓ 退火 T↓ ； 若 Tm 较高，可使退火和延伸在同一温度 （ 3) 延伸 ： 72 ℃ 1min/kb （ 10kb 内） 一般： 40 － 60sec 温度和时间 平台效应 ? PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可用 Y ＝ (1 ＋ X) n 计算。 Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数， X 表 示平均每次的扩增效率， n 代表循环 次数。平均扩增效率的理论值为 100% ， 但在实际反应中平均效率达 不到理论值。 ? 反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈 指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累， 引物、底物的消耗、 DNA 聚合酶活 性下降及非特异性产物的竟争等因素， 被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加， 而进 入线性增长期或静止期，即出现 “停滞效应”，大多数情 况下，平台 期 (Plateau phase ) 的到来是不可避免 的。 Plateau phase in PCR apoB 基因 PCR 反应体系和反应步骤 体系 25 ? l Mix 12.5 ? l 引物 2 ? l ddH 2 O 6.5 ? l 模板 4 ? l 步骤 温度 时间 预变性 94 ℃ 5 min 变性 94 ℃ 1 min 退火 + 延伸 60 ℃ 4 min 延伸 60 ℃ 10 min 35 cycles 循环数 （四） PCR 的特点 ? 操作简单 ? 省时： 1-2 hr ? 灵敏度高： pg ? 特异性强 ? 对原始材料质量要求低 ? 有一定程度的单核苷酸错误掺入 ? 适用于克隆序列清楚的基因 （五） PCR 的应用 ? 1 ．遗传病的产前诊断： 如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺 乏； ? 2 ．致病病原体的检测 ： 对于难于培养的病毒（乙肝），细菌（如结核、 厌氧菌）和原虫（如梅毒螺旋体）等来说尤为适用。； ? 3 ．癌基因的检测和诊断： 白血病残留细胞的定量（包括慢粒和急粒）， 肺癌中 P53 及 Rb 等抗癌基因的失活，神经质瘤 N-myc 基因的激活和表达； ? 4 ． DNA 指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证： 肌红蛋白小卫星 基因， β - 珠蛋白基因、 ApoB 基因等的多肽性和重复次数的差异都被应用 于鉴定，骨髓或脏器移植配型及动物种系的研究 ； ? 5 ．动、植物检疫： 检查出入国门的人员、动、植物（种畜、种籽）等 是否携带烈性传染病（艾滋、动物病毒、植物病毒等）病原体，食品、 饲料等是否带沙门氏菌等 ； ? 6 ．高科技生物医学领域中的应用 在转基因动植物中检查植入基因的 存在。 ? 7. PCR 技术尚可应用于 基因拼接、测序 等领域。 实验二： PCR 检测 apoB 基因多态性 中山医学院生化教研室 实验内容 ? 1 、基因 PCR （已完成）； ? 2 、鉴定 apoB 基因 PCR 产物的 DNA 凝胶电泳： 1.5% 琼脂糖凝胶浓度， 100V ， 1h ； 1 原理 在 pH8.0 （碱性）的环境中 DNA 的磷酸基团解离， 使 DNA 在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向 泳动，因为各种 DNA 分子的电荷数、分子量、构象 不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力 不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。 DNA 显色剂多用 EB ，它能和碱基间的氢键结合， 在紫外光照射下呈橘红色（ 530nm ）的荧光。 3 一、 DNA 琼脂糖凝胶电泳 1.1 影响 DNA 在凝胶中迁移速率的因素 ? 1 DNA 分子的大小：分子量越大，迁移速度越慢； ? 2 构象：共价闭环 DN