实验四 细胞吞噬及ACP染色2009-3.pptVIP

实验四 细胞吞噬和酸性磷酸酶染色（Gomori氏法） 一、实验目的 1．通过观察四膜虫吞噬碳粒和豆奶的过程，加深对细胞吞噬作用意义的理解。 2．明确酸性磷酸酶（ACP）与溶酶体的关系，掌握Gomori法的原理和基本操作。 二、实验原理 1、溶酶体的结构 溶酶体是普遍存在于所有动物细胞（哺乳动物的成熟红细胞除外）中的细胞器，在不同类型及不同功能的细胞内，溶酶体的数量及分布不完全相同。大量研究表明，溶酶体中含有多种酸性水解酶，能分解内源性和外源性物质，在细胞的生理和病理过程中起重要作用。 溶酶体由单位膜包围，直径约0.5微米。用电镜细胞化学技术证实溶酶体含有核酸酶、蛋白酶、糖苷酶、酯酶、磷酸酶和硫酸酯酶六大类水解酶。 2、溶酶体的主要功能 溶酶体是细胞内的消化器官，细胞自溶，防御以及对某些物质的利用均与溶酶体的消化作用有关。 高等动物体内存在具有防御功能的吞噬体系，如单核细胞和嗜中性粒细胞，在细胞的非特异性免疫功能中发挥重要作用。单核细胞能吞噬、清除受伤、衰老的细胞等，它起源于骨髓干细胞，在血液中分化为巨噬细胞。巨噬细胞中含有丰富的溶酶体，其细胞表面形成伪足和微绒毛。 吞噬与胞饮： 细胞膜对于大分子物质是不能渗透的，这些物质一般通过胞吞作用进入细胞。胞吞作用在各种动植物细胞中普遍存在。若内吞物质为固体称为吞噬作用，若为液体则称为胞饮作用。 吞噬过程：首先把异物吸附在细胞表面，随之，吸附区域的细胞膜内陷，将异物吞入胞质，形成吞噬泡。继而细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡融合，形成吞噬溶酶体，把病原体杀死，异物消化分解。 酶是生物催化剂。酶有高度的特异性，它仅作用于一种或一类底物。因而，将酶催化其底物形成的最终产物显示出来，也就间接地显示了酶。 酶细胞化学是利用酶催化反应形成的产物能在光镜或电镜下被识别的原理，来研究酶在组织细胞内的定位及其活性变化的技术。 影响酶活性的因素 1）温度对酶活力的影响。 高于37 ℃时酶往往失去活性，通常合适的温度是4-30 ℃。 2）pH值对酶活的影响。 酶的作用液通常采用恰当pH值的一定缓冲液来配置。 3）经常采用新鲜组织的冰冻切片或临时制片。 4）固定剂要求对酶活力影响小。 显示酶经常采用甲醛类试剂。 4、酸性磷酸酶的显示原理 溶酶体含多种酸性水解酶，酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）是溶酶体的标志性酶。利用酸性磷酸酶与底物反应后形成的棕黑色沉淀，可以显示溶酶体的分布。 在溶酶体膜稳定完整时，底物不易渗入，ACP活力微弱或无活性，经固定，在合适pH条件下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗透性，底物可以渗入，酶活力被显示。 酸性磷酸酶在pH4.5~5.5时起作用，分解β-甘油磷酸释放出磷酸基团，磷酸与铅离子结合生成无色的磷酸盐沉淀，磷酸盐再与硫化铵作用，生成棕黑色的硫化铅沉淀，从而显示出酸性磷酸酶所在的位置。 反应过程： β-甘油磷酸钠 ? 甘油 + PO43 - PO43 – +Pb(NO3)2 ? Pb3(PO4)2 ?（无色） Pb3(PO4)2 + (NH4)2S ? PbS ? （棕黑色） 三、实验材料、器具和药品 l? 每一个学生 复式显微镜（带油浸物镜）（microscope） l? 每一组学生 擦镜纸（lens paper）；记号笔；小片滤纸；载玻片；移液枪（配套枪头）；染色缸 四膜虫培养液（200μl）； 0.1%油烟墨汁（100μl）；2%豆奶液（100μl）； 大染色缸：10%福尔马林溶液；酸性磷酸酶作用液；0.2%硫化铵水溶液（现用现配）；自来水。 l? 每四个学生 香柏油（cedar wood oil）、二甲苯（xylenol）；亮绿 l? 整个实验班 高速离心机2台；温箱1台；水浴锅2台；烘箱1台 四、实验操作 1．吸取四膜虫培养液100μl加入到2% 豆奶液的离心管中，混匀，放置7分钟。 2．3000rpm离心（对称放置，平衡）1分钟，迅速吸去上清100μl （沿离心管侧壁吸，小心不要搅动起沉淀物），然后用“吹打法”将沉淀悬浮于所剩的残留液中。 3．取 10μl悬浮液，滴于一张干净的载玻片的下方，涂布开来（如实验二涂片，每人2张标本片）。两片标本置32℃ 温箱中15分钟，令其彻底干燥。 4．将两标本于10%福尔马林中固定10分钟，取出。放自来水中1分钟。取一片标本做记号，于100℃干烤10分钟（使酶失活，做对照）。另一片（做样品）置于室温。 5．将标本片放入酶作用液中（37℃水浴），20分钟。（一组四片） 6．自来水中浸泡，1分钟。换水后重复一次操作。 7．将标本片放入0.2% (NH4)2S中，反应1.5分钟。 8．自来水中浸泡，1分钟。换水后重复一次操作。 9．滤纸吸干玻片背面的水，待彻底干燥后用