荧光PCR实验故障排除.pdf

荧光PCR实验故障排除 张庆 Application Specialist Molecular & Cellular Biology 提供线索的软件页面 扩增曲线-Amplification Plot 标准曲线-Standard Curve 原始数据-Component 各波长的原始信号-Spectra 融解曲线-Dissociation Curve [原始图谱] [导数图谱] 实时定量故障排除 没有标准曲线 没有标准曲线 没有扩增曲线 Amp Plot Component 没有扩增曲线 Spectra 原始数据只有1个循环 没有扩增曲线 • 原因1：PCR参数设置错误 – 数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。 没有扩增曲线 • 原因2 ：硬盘休眠 电脑休眠，数据通讯中断 基线下滑 基线下滑 • 从原始数据找原因 – 1-9循环，ROX 的信号下 降，与试剂质量有关； – 基线设定4-13范围内， ROX信号值变化，FAM 的信号值基本固定； FAM/ROX 的校正后，基 线不是水平的直线； – 应该取ROX信号稳定的 10-20循环为合理的基线 范围。 基线下滑 • 修改基线范围为10-20，重新分析： 基线下滑 • 基线范围取10-20循环的数据，重新分析后的图谱； • 1-9循环的信号为负数，与试剂质量有关。 奇怪的荧光曲线 原因：基线的终点大于C 值 T 通常是因为模板DNA浓度偏高，C 值 < 15，而基线范围仍然取3- T 15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高 解决方法：减小基线终点至CT值前4个循环，重新分析数据 样品浓度跨度太大 直线扩增曲线 • 原因：探针部分降解 V形扩增曲线 V形扩增曲线 • 双击纵坐标，打开Graph Settings • 关闭Y轴Auto Scale • 设置到正常范围如0-12000 V形扩增曲线 • 扩增曲线是水平直线 • 没有检测到信号升高－提示没有扩增 • 建议 将纵坐标设置到适当范围，以观全貌 扩增微弱或者信号很弱 ROX信号不稳定 扩增曲线不光滑 Rn 扩增曲线不光滑 • 原因：信号太弱 如果信号>10000点，就不会 打折 净高26000点 弱的信号经过校正后，点 与点之间的差异被放大