2009-1012干细胞研究重大项目精品合辑02.pdfVIP

项目名称： 诱导多能干细胞（iPS）的重编程机制 首席科学家： 王纲 中国科学院上海生命科学研究院 起止年限： 2009.1 至2013.8 依托部门： 中国科学院 一、研究内容 基于以上的立项依据，本项目的主要研究内容将集中在以下几个方面： 1． iPS 细胞被重编程的分子机制 从核移植（克隆动物的基础）我们得知，细胞核可以被胞质重编程。iPS 的 出现说明四个因子（或其他几个因子）可以重编程体细胞。目前我们不知道使重 编程发生的关键分子事件是什么。我们将从表观遗传修饰的改变、microRNA 的 变化和基因表达谱的变化几个方面来研究iPS 中重编程的分子机理。 1.1 表观遗传变化 基因表达活性调控的机制主要是通过染色质水平的化学修饰（包括组蛋白上 的修饰），形成有转录活性的常染色质和无转录活性的异染色质区域。染色质组 分（组蛋白与DNA ）的各种修饰在细胞内由不同的酶类催化完成。胚胎干细胞、 成体细胞或已分化细胞具有各不相同的特异性的染色质修饰谱式。这些修饰谱式 在体细胞去分化时发生逆转（重编）。已有实验证明MEF 细胞的Oct4 和Nanog 基因的启动子在iPS 形成过程中发生去甲基化。由于DNA 甲基化引起基因转录 沉默，因此去除全能性基因上的DNA 甲基化是激活全能性基因的重要步骤。也 是iPS 诱导过程中一系列分子事件中的一大限速步骤。同时，由于在转录调控中， DNA 甲基化和组蛋白的修饰属于一起发挥作用的共同体，因此，研究DNA 甲基 化在iPS 中的作用，必须要研究该过程中组蛋白修饰的变化。我们将在iPS 诱导 系统中，利用ChIP-on-chip 芯片研究分析和发现组蛋白修饰的动态变化。在此基 础上，通过有目的地改变DNA 甲基化和组蛋白修饰的动态平衡，探索简化iPS 诱导方法的可能策略，如不依赖反转录病毒导入外源转录因子等。阐明体细胞重 编程过程中各分子事件间的相互联系,进而为iPS 技术革新提供依据。 1.2 microRNA 的改变 诱导已分化的体细胞成为多能性的干细胞(iPS)是一个复杂的过程。最近的研 究发现microRNAs 在维持干细胞的多能性发挥了重要的作用, 破坏microRNA 会 导致胚胎干细胞分化异常以及精原干细胞在体内的缺失。研究发现，小鼠和人的 胚胎干细胞拥有一套特异的microRNAs ，它们定位在染色体上成一簇，并与 Oct4,Sox2 和Nanog 有相互作用，提示这些microRNAs 参与维持胚胎干细胞的多 1 能性。因此我们推测microRNAs 在iPS 的诱导和维持中也有重要作用，是全面 解析iPS 诱导分子机制不可缺少的一部分. 我们将进行以下的研究：1，用Lentiviral 病毒载体来诱导表达Oct4 ，Sox2， Nanog ，Lin-28 ，建立可重复的iPS 诱导系统,分析和发现general microRNAs 和胚 胎干细胞特异的microRNAs 被激活的时间图谱；2 ，然后选择在不同时间激活的 胚胎干细胞特异的microRNAs 与Oct4 ，Sox2，Nanog 共转染分化细胞,分析相应 的microRNA 是否对iPS 的诱导有促进作用；3 ，在前述基础上，选择有明显促 iPS 诱导作用的microRNA ，以此为探针，寻找其在调控多能性干细胞的信号传 导和表现修饰的靶点以及调控机制。 1.3 iPS 中的信号通路 iPS 细胞是通过在成体细胞中转入四个因子（即转录因子）实现的。除了表 观遗传学修饰改变以外，转入的转录因子必然引起相应的基因转录激活等一系列 事件。因此我们将对iPS 细胞在基因表达水平上进行广谱性的研究，了解体细胞 重编程过程中有哪些基因表达发生显著改变；这些显著改变的基因具有怎样的时 序表达规律；这些显著改变的基因之间可能形成哪些关键的调控网络，它们决定 着重编程的全过程以及细胞的命运。我们将1. 分析体细胞、iPS 以及胚胎干细 胞（ESC ）的基因表达差异，确定显著性上调的和下调的基因；2. 分析体细胞在 重编程过程中不同时间的基因表达变化，确定每一天显著性上调和下调的基因， 从而明确基因表达在整体水平上的时序性；3.