整理)慢病毒稳转细胞株步骤.docVIP

竹密岂妨流水过蛮鬼2018.3山高哪碍野云飞 PAGE 5/5（稳转） 稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃ 第二天 1、配管 试剂 加样量/μl 推荐量/μl、μg 合计 A管 PLKO.1/pCDH 3 206 psPAX2 1 pMD2.G 2 Opti 200 B管 XTREME-GENE 6 206 Opti 200 A+B混合室温静置20min 2、加入2ml全培养基DMEM 3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基 第四天第五天： 1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存） 2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞 3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次 4、4℃过夜 第六天 1、4℃，3500rpm，20min 2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体 3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶 4、50μl分装，-80℃保存。 <二>慢病毒转染靶细胞 前期预实验MOI（步骤同正式试验）（见三2,直接订购病毒液时才需要） 细胞种类 DU145 PC3 22RV1 LNCaP RWPE-1 MOI 2 4 2 2 前期测病毒滴度（稀释法，还有一种qPCR法见资料） 1、第一天：准备96孔板，每孔加入10000个293T，为每个病毒准备20个孔（稀释10个浓度，各2个副孔）。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。 2、第二天：在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入207μl培养液，往第一个管中加入23μl病毒原液，混匀后，吸取23μl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。 吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。 3、第三天：换液 4、第四天：观察结果并计算滴度 在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）/2/X孔的病毒液的含量（μl ）×1000。（前面算出的是没μl病毒量，所以乘于1000） 第一天： 1、种板（12/24孔板）需第二天为50%-70%，大约12孔板1×105 细胞种类 种板数 收获细胞数 DU145 PC3 22RV1 LNCaP RWPE-1 第二天 1、准备病毒液（可在第一天做）：在冰上融解 2、准备完全培养基和 Polybrene 混合物（1:1000-1:2000稀释，终浓度在5-10μg/ml之间），加入相应培养板中（6孔板2ml，12孔板1ml，24孔板500μl） 3、加入浓缩病毒液（12孔板30μl-50μl）（如果是直接购买病毒液需根据MO