基因工程乙肝疫苗的制备.pdfVIP

基因工程乙肝疫苗的制备 【摘要】基因工程乙肝疫苗是通过构建含有乙肝表面抗原的重组质粒转染酵母细胞，制备乙 肝病毒表面的有效蛋白。本文主要介绍基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗制备的基本原理和 工艺流程，以及乙肝疫苗的纯度分析方法。 【关键词】乙肝疫苗 重组质 工艺流程 1.基因工程乙肝疫苗产生背景 疫苗是人类目前可以彻底消灭某一疾病的唯一武器，接种疫苗被认为是最有效、最经 济的疾病预防手段。《发展中国家消灭乙型肝炎免疫接种计划实施指南》中指出： “世界上 四分之三的人口生活在中或高乙肝流行区，因此，唯一的策略就是有效地减少乙肝的流行， 最终消灭乙肝······” 世界卫生组织肝炎专家及计划免疫全球咨询组认为：控制全球乙型肝炎及减少死亡的 策略是开展大规模的婴儿及学龄前儿童的乙肝疫苗接种。 我国卫生部制定的目标是从 92 年开始在全国逐步推行乙型肝炎（HB ）计划免疫。92 年全国共生产血源疫苗 1500 万人份，尚不能满足新生儿接种需要，如考虑其他人群，缺口 更大。为了实现 HB 计划目标，进一步为控制全球 HB 做出贡献，我们必须大规模提高 HB 疫苗的产量和进一步提高质量。 血源 HB 疫苗原料为无症状带毒者的 HBsAg 阳性血浆。血源价格昂贵，供应量有限， 采集困难。因此血源疫苗的产量和成本受到原料的限制。利用基因工程重组微生物细胞表达 HBsAg 生产 HB 疫苗的技术，原料易得，价廉，适宜进行大规模生产，有可能大幅度降低 成本。 2.使用重组酵母的原因和重组酵母构建 2.1 使用重组酵母的原因 使用重组酵母进行乙肝疫苗的大规模生产，有如下几点原因： （1）.酵母对培养基的要求低，价廉易得。 （2 ）.酵母细胞生长快，故生产率高。 （3 ）.动物细胞生长慢，容易染菌，对操作要求严。 （4 ）.酵母系统容易放大，动物细胞系统放大难。 2.2 重组酵母构建 HBV 只有 3200bp，为双链的DNA,是一个相当小的病毒。其基因组共有四个 ORF ，编 码以下一些蛋白：Core 蛋白和 pre-core 蛋白，Pol 蛋白，X 蛋白，以及 S 蛋白（L 、M 、S）。 故重组酵母可用以下方法： 目的基因分离 重组质粒的构建（切，接） 导入酵母细胞（转） 培养酵母细胞（增） 检测正确表达目的产物的酵母（检） （1）.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化学合成法直接合成目的 基因或者通过鸟枪法克隆目的基因。用识别相同黏性末端的限制性内切酶将外源 DNA 和质 粒分子切开。（切） （2 ）.用 DNA 连接酶将含有外源基因的 DNA 片段连接到质粒分子上，构成 DNA 重组分子。 （接） （3 ）.借组细胞转化手段将 DNA 重组分子导入酵母细胞内。（转） （4 ）.短时间培养转化酵母细胞，以扩增 DNA 重组分子。（增） （5 ）.筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的基因工程菌。（检） 3.酵母表达的 HBsAg 之特性 重组酵母表达的 HBsAg 在没有化学处理的条件下自发地构成平均直径为 22nm 的球形 颗粒。这些颗粒含有未糖基化的 HBsAg 多肽和主要由酵母特有的磷脂构成的脂基。其氨基 酸的构成、羟基和氨基酸末端序列分析、质谱仪分析的肽谱等表明，重组酵母忠实地表达和 生产了 HBsAg 。 酵母生产的 HBsAg 在细胞内以颗粒形式存在，其中的亚单位通过非共价键不紧密地结 合在一起。在细胞外它转变成第二种形式，即单个多肽通过二硫键结合成二聚体，最后二聚 体之间形成二硫键，得到二硫键交联的颗粒。它在表观上、化学性质和免疫性等方面都与血 源 HBsAg 类似。 HBsAg 比大部分生物分子要大，但比细胞要小，很适宜用膜分离方法纯化。 HBsAg 表现出很强的疏水性，可用硫酸铵或聚乙二醇进行分步沉淀，或用疏水层析纯 化。 HBsAg 含有大量的二硫键，是其对热稳定的主要原因。在制备血源疫苗时，可运用长 时间保温法以灭活 HBV 。但在制备重组HBsAg 时没有必要。可选用更加温和的条件。 HBsAg 对蛋白酶的抵抗力很强，可在 pH 为 2 的时候耐胰蛋白酶的处理。 HBsAg 因其脂含量高，密度比一般蛋白低。利用其密度特性，可进行梯度离心分离。 4.疫苗的工作原理