微生物应用基础 细菌的分离筛选 教学课件-细菌的分离.pptVIP

微生物的菌种选育- 细菌的分离筛选 大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌的分离 一、原理 伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。 材料和器皿 二、材料和器皿 1、菌种：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的混合培养斜面菌种。 2、培养基：伊红美蓝琼脂培养基。 3、器皿：无菌培养皿，水浴锅，接种环，培养箱等。 操作步骤 三、操作步骤 1、融化培养基 将装有伊红美蓝琼脂培养基的三角瓶放入热水浴中加热至沸，直至充分融化。 2、倒平板 待培养基冷却至50℃左右后，按无菌操作法倒平板(每皿约倒15ml)，平置，待凝。 操作方法：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用右手手掌和小指将瓶塞轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一条稍大于瓶口的缝隙，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 3、作分区标志（操作熟练后此步骤可省略） 在皿底用记号划分成4个不同面积的区域，使ABCD，且各区的夹角应为120°左右，以便使D区与A区所划出的线条相平行、美观。 4、划线操作 （1）挑取菌样：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。 （2）先划A区：将平板倒置于酒精灯火焰旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并让平板面向火焰。右手持含菌的接种环，先在A区轻巧地划3~4条连续的平行线当作初步稀释的菌源。烧去接种环上的残余菌样。 （3）划其余区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转至划线位置，把接种环通过A区(菌源区)而移至B区，随即在B区轻巧地划上6~7条致密的平行线，接 着再以同样的操作在C区和D区划上更多的平行线，并使D区的线条与A区平行(但不能与A区或B区的线条接触！)，最后，将左手所持皿底放回皿盖中。烧去接种环上的残菌。 5、恒温培养 将划线后的平板至37℃倒置培养2~3天。 6、挑单菌落 良好的结果应在C区出现部分单菌落，而在D区出现较多独立分布的单菌落。然后从典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面，经培养后即为初步分离的纯种。 7、清洗培养皿 将废弃的带菌平板作煮沸杀菌后进行清洗、晾干。 注意事项 1、平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。 2、用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。 3、用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。 4、为了取得良好的划线效果，可事先用圆纸垫在空培养皿内画上4区，并用接种环练习划线动作，待通过模拟试验熟练操作和掌握划线要领后，再正式进行平板划线。 思考题 1、用平板划线法进行纯种分离的原理是什么？有何优点？ 2、要防止平板被划破应采取哪些措施？ 3、为什么在划完A区后要将环上的残菌烧死？划后面几区时是否也要经过同样的处理？