核酸纯度检测.pdfVIP

. 最近重新研读了分子克隆第三版， 有一个有趣的小发现， 好像过去没听人说 过。一般测核酸浓度都是用 260nm的光吸收值来决定， 同时用 260/280 的比值来 判断有无蛋白质污染。 理想的比值是 1.8~2.0 左右。分子克隆第三版专门提到这 种判断核酸纯度的办法是不可靠的。 原因在于蛋白质在 260nm的消光系数比核酸 小很多，即使有相当多的蛋白质污染，这个比值还是接近于理想的比值。另外， 260/280 比值尤其不能用于评判寡聚核甘酸的纯度， 因为嘌呤的消光系数比嘧啶 大好多，寡聚核甘酸嘌呤嘧啶组成很可能不平均，所以很可能出现很纯的样品 260/280 比值却比较小的情况。 你所说的 消光系数‘ ，是否就是吸光值的意思？如果你‘ 用连续波长测过核酸 的吸光度时， 就会发现， OD260,恰好是核酸吸光值最大的时候， 从 200-750,是一 条曲线， 260 时是波峰，而 280 时，刚好是曲线下降到一半左右时的吸光值。而 恰好 280 又是蛋白质的最佳吸收值。 如果纯的核酸， 那曲线就是标准的， 260/280 就是 1.8-2.0 之间，如果混有蛋白质，多肽，酚之类的杂质，那 280 时的吸收峰 就变高了，曲线随之发生变形， 而 260 时的吸收峰不变。 就如你所说的 “原因在 于 蛋白质在 260nm 的消光系数比核酸小很多 ”，因此 260 的吸收峰几乎不变。但 280 时却不一样。这时相反，核酸的消化系数比蛋白质小的多，因此，一旦有污染， 280 上升很快。因此 260/280 在有污染的情况下就会变小。 所以，用 260/280 的 方法，还是比较可靠的。当然更可靠的，就是用 200-750 的波长，连续扫描。直 接观察核酸的整条曲线，那比光靠 260,280 两个吸收值，肯定要准确很多。其实 平时在我们检测时，我们也会检测 230,320,两个值。至于这两值的作用，我稍后 再说。其实有 230,260,280,320,这四个点。基本上也能确定下这条曲线的该一段 的形状了。 A 260 / A 280 的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。 纯净的样品，比值大于 1.8 （DNA ）或者 2.0 （RNA ）。如果比值低于 1.8 或者 2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。 A 230 表示样品中存在一些污染物， 如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320 检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品， A 320 一般是 0。（320 差不 多也就是那条曲线刚下降到 0 的时候）。 所以，当我们检测 260/280 后，如果比值在 1.8-2.0 之间时，我们可以说其纯度 可以，那 OD260 的值就有效。否则， OD260 的值判为无效。你说的嘌噙与嘧啶 的吸光值，确实没错。但一般情况下，我们测的都是基因组、 tRNA ，mRNA 、 cDNA ，所以其 CG 含量都比较均匀。都适用于这种方法。然而，在测某些 CG 含量明显不均匀的情况下，比如人工合成的寡核苷酸、引物，在