原位杂交探针设计原则.pdfVIP

原位杂交探针大体可分为三类：寡核苷酸探针， cDNA 探针， RNA 探针。 寡核苷酸探针由 25bp 左右的核苷酸组成，通常可以由公司合成，由于其序列 较短，因此特异性较强，原位杂交时可以区分家族基因，同一基因的不同剪切 体， cDNA 探针长约 500bp 左右，可以通过非对称 PCR 扩增合成，由于探针 式 DNA ，可以有效的避免降解，但 DNA 和 RNA 的结合不如 RNA 与 RNA 结 合强，通常不采用， RNA 探针长约 500bp 左右，通过体外转录合成，如果设 计合理，其特异性是可以得到保证的，其主要缺点是容易被 RNAse 酶降解。 查看原位杂交相关的文献发现， 2000 年以前的原位杂交常使用放射性标记 的寡核苷酸探针，通过胶片曝光来显色， 2000 年以后的文献常使用 RNA 探 针。许多肾脏发育的文献虽然有很多原位杂交数据，但却没有附带上探针序列 或者用于探针模板克隆的引物，通过了解厦门黄老师斑马鱼和昆明毛炳宇爪蟾 中原位杂交探针设计方法，我们可以采用 RNA 探针。文献中很难找到关于 RNA 探针设计的原则，有的文献报道直接用 cDNA 合成 RNA 探针。借鉴爪蟾 中原位杂交探针设计流程，以小鼠 FGF10 的探针设计为例进行介绍。 1. 在 NCBI 数据库中下载该 FGF10 的 mRNA 全序列，然后用 FGF10 的全长 在 NCBI 中 进 行 BLAST 比 对 分 析 ， 比 对 数 据 库 选 择 mouse genome+transcript ，比对程序选择 somewhat similar sequence 。 Zebrafish seqRNAs 精选文档 得出的比对结果中有一幅图谱，显示比对序列与数据库中序列的相似性，探 针应设计在与其它基因不存在明显相似性的区段，在比对结果的图谱中选择 可变区。如下图黑色框区域。 2. 估计黑色框碱基在 FGF10 mRNA 中的大致范围，在这个范围内选择长约 500bp 的序列设计探针。根据上图信息，我们选择 FGF103000~3800 的范 — 2 精选文档 围进行探针设计。 agcac agaggcacaa tgctttggtt tatgggtata ggttgcattt 3301 tgtggtgttc tttcaacttg ttttctgaca aatgggattt ttaaaatgta tacttcttgt 3361 ggttggattc tgtatgttag agtttaattg gtaactgagt ctaaaggctc taatgtaatg 3421 aatctctaga agaactaggt atcttttttt acttttattt taaaataata attatacctg 3481 acacatgacc atggaccacc cacaaccaaa attaaatgtt tggggagaca aactatagta 3541 ttcagtgaca agggtaacag caaatagtgc agacgttgga ttcttatttc a