真菌药敏试验方法比较培训课件.ppt

真菌体外药敏用培养基 常量肉汤和微量肉汤法RPMI1640液制备： RPMI 10.4g MOPS（三氮吗啡啉丙磺酸） 34.53 g 蒸馏水900ml溶解后，用1M NaOH调节PH至7.0（25℃）， 用蒸馏水溶至1000ml， 高压灭菌后，冷却至50 ℃ 加入RPMI1640用0.22μm滤膜抽滤除菌，4℃保存。 ;.; * 真菌体外药敏用培养基 E-test法 ： 在RPMI液体培养基中补充葡萄糖，使其终浓度为2%。 NCCLS纸片扩散法 ： Mueller-Hinton 琼脂 补充2%葡萄糖和0.5μg/ml美蓝 丹麦ROSCO纸片扩散法 ： 改良的SHADOMY（ PH7.0）培养基 主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸缓冲液等。 ;.; * 菌液制备 将受试菌在沙保罗培养基上转种，以保证其纯度和活性。用0.85%的盐水制成酵母菌悬液，调整其浊度达到0.5麦氏比浊标准（约为1~5×106CFU/ml）。 常量稀释法：用RPMI1640液体稀释2000倍 接种浓度约为0.5~2.5×103CFU/ml 微量稀释法：用RPMI1640液体稀释1000倍 接种浓度约为1～5×103CFU/ml E-test法和NCCLS纸片扩散法：用菌液浊度为0.5麦氏单位。 Rosco纸片扩散法： 1. 念珠菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀(1~5×105CFU/ml) 2. 隐球菌属： 1.0麦氏浊度 3. 其它酵母菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释 ;.; * 常量肉汤法(M27-A) 先将氟康唑粉末溶于蒸馏水，然后用配制好的RPMI1640液倍比稀释，使其起始浓度为640μg/ml, 终末浓度为1.25μg/ml，分装无菌洁净的12mm×75mm试管： 64 32 16 8 4 2 1 0.5 .25 .125 ＋ － 前10管： 0.2ml氟康唑＋1.8ml菌液 念珠菌属 35 ℃孵育48小时 新型隐球菌 72小时 读取MIC结果 2ml菌液 1.8ml1640 ;.; * 常量稀释法 药敏结果判定 氟康唑，伊曲康唑，两性霉素为100%抑制 其他唑类药物为80%抑制 （取0.2ml的生长对照菌液加入0.8mlRPMI液体培养基的菌液浓度） 质控株 克柔念珠菌ATCC 6258 近平滑念珠菌ATCC 22019 白念珠菌ATCC 90028 白念珠菌ATCC 24433 ;.; * 微量肉汤法 氟康唑的稀释方法同常量法，但起始浓度为2×常量法的浓度（即128μg/ml ），终浓度为0.25μg/ml 。 。37℃ 。37℃ 64 32 16 8 4 2 1 .5 .25 .125 ＋ － 氟康唑：1-10孔分别为 100ul 菌悬液：1-10孔分别为 100ul 200ulRPMI汤 200ul菌悬液 35 ℃ 新型隐球菌72小时 ， 其余菌株 48小时读取MIC结果 ;.; * 酵母菌的NCCLS M27-A各药物折点 粘膜及系统性感染： 氟康唑（除克柔念珠菌） 敏感： ≤ 8μg/ml 中介： － 耐药： ≥64μg/ml 粘膜感染： 伊曲康唑 敏感： ≤0.125μg/ml 中介： －