蛋白表达纯化毕生精华.pdfVIP

蛋白表达纯化实验步骤 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR，KOD 酶扩增获取目的基因cDNA. 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32 等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、 Bl21codon （DE3）等。 7、蛋白的诱导表达。 1）将表达菌株在3ml LB 培养基中摇至OD 0.6 左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h 以上即有大量表达)。 2）SDS电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3）将有表达的菌株 10%甘油保种，保存 1ml 左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm 过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。 4）用上述IPTG 浓度范围的最低值诱导10ml 表达菌，18度，低转速 （140-180rpm）， 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG 之前的培养基中加入 1%的葡 萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl 一管，每次用一管，避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见 附件2 9、如有上清表达，则扩大摇菌。 1）取保种的表达菌株先摇 10ml，37 度，300rpm 摇至OD 1.5，约5h 左右，视菌种 的活性而异，也可过夜摇菌。 2）将上一步中的8ml 加入 300ml 培养基中37 度，250rpm 摇至OD 1.0 左右 （约 2.5h~3h），然后加IPTG （浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当 的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。 拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底 晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。 3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度 （18°左右），转速 140rpm 左右。 4）将菌液6000rpm，4min，4 度 离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓 冲液重悬。每250ml 菌液用30ml 到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用 4 支50ml 的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。 10、 超声波裂解。 1）用6mm 变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min 即可。 注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部， 尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。 4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成 （后 面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30 分min 要休 息5min （即关闭总电源开关）。 注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂 （PMSF），PMSF 工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解 60 分钟，60 分钟足够裂解。 11、 取得上清 1）将破碎好的溶液收集到50ml 离心管中。10000rpm，15min，4°离心。沉淀为包涵 体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。（此时可 以测量一下pH 值，pH 值最好在7.5左右。平衡buffer 的pH 是7.8左右，裂解后 上清就会在7.5左右。） 12、 纯化上清摸洗脱条件。 1）镍柱处理。将 1ml 镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。 2）将 10ml 上清加到已经平衡过的NI 柱上，并将过柱的样品重复上样3 次。（若是流