第三章细胞工程课件.ppt

? 无机盐 ： 有不少盐可用来提供“大量元素”和“微量 元素”，表中给出了常用培养基中无机盐的含量。 ? 碳源和能源 ：培养中的细胞对蔗糖和葡萄糖都能利用，果糖 的利用效果较差。培养基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖， 葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源， 但效果不佳。 ? 维生素 ：培养中的植物细胞都需要硫胺素，加入烟酸、泛酸、 生物素和叶酸，效果更好。原生质体培养通常需要大多数必需 维生素。 ? 氨基酸 ：虽然植物细胞在培养过程中一般都能合成所需的氨基 酸，但加入 L- 谷氨酰胺或其他氨基酸混合物是很有好处的。此 外，还使用蛋白酶解产物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。 ? 植物生长激素 ：激素分为两类，生长素和分裂素。生长素促 进细胞生长，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸；分裂素 促进细胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是 6- 苄氨 基嘌呤和玉米素，对芽的诱导具有重要作用。分裂素和生长素 通常一起使用，来促进细胞的分裂、生长。 3. 植物细胞培养方法 ? 植物细胞培养类型： 按培养对象可分为单倍体细 胞培养和原生质体培养；按培养基可分为固 体培养和液体培养；按培养方式又可分为悬 浮培养和固定化细胞培养。 (1) 植物细胞悬浮细胞培养 ? 悬浮细胞培养技术： 是指把离体的植物细胞悬浮 在液体培养基中进行的无菌培养。 ? 悬浮培养优点 ： 一是增加培养细胞与培养液的 接触面，改善营养供应；二是在振荡条件下 可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累 而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以 适当改善气体的交换。 ? 植物细胞悬浮培养与微生物有许多相似的地方，但两 者又存在着明显的不同。例如，植物细胞对剪切力敏 感、易结团、需光照等条件。此外，植物细胞生长缓 慢，发酵时间长，维持无菌操作更为困难。 ? 对剪切力敏感 ：植物细胞的个体大，细胞壁僵脆且 具有大的液泡，这些特性决定了其对剪切力十分敏 感。过高的剪切力可使细胞受到机械损伤，细胞体 积变小，细胞形态和聚集状态改变；或使细胞自溶， 胞内化合物释放；也可能导致细胞的活性丧失。 ? 结团 ：绝大多数植物细胞在悬浮培养时是结成直径 小至 100 μ m ，大至几毫米的小团。其主要原因是 细胞分化后不能很好地分开，另外生长后期分泌的 多糖类物质也有助于结团。过大的细胞团容易下沉， 造成混合困难，而且还影响传质，使中心的营养和 供氧不足，影响产物的合成能力。 ? 需光照 ：大多数植物细胞，次级代谢产物的合成受 光照的影响，一些研究显示光照对于胡萝卜素、黄 酮、花青素等的合成有促进作用。 ? 一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足的基本条件 ： 一是悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；二是均一 性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观 为大小均一的小颗粒，在倒置显微镜下观察为体积和 形状大致相同的细胞团；三是生长迅速，悬浮细胞的 量一般 2-3 天甚至更短时间便可增加一倍。 ? 在建立悬浮细胞系时需注意以下事项： 1. 选择合适的外植体 ：由外植体直接诱导的愈伤一般是不适合悬 浮培养的，需要通过一定的途径进行筛选、改良，获得适合悬 浮培养的愈伤，其影响因素有： (1) 外植体：对于不同植物，外植体的选择差异较大，如树木和花 卉的叶片、茎尖、芽尖等都可作为外植体诱导愈伤，草坪草用 幼穗往往可获得较成熟种子更高的愈伤诱导率。在诱导率较高 的基础上更容易快速建立起高频再生的悬浮细胞系。 (2) 基因型：适合悬浮培养的基因型在连续的继代培养过程中表现 出好的适应性，在震荡培养两个月后，细胞团逐渐变小，均匀， 生长旺盛。而不适合悬浮培养的基因型在连续的继代培养过程 中，细胞团大而致密，生长速度慢，生长状态不均匀。 2.3 细胞融合技术 ? 2. 继代挑选与培养技术 ：对于愈伤的挑选，是建立良好悬浮体 系的关键。诱导出的初代愈伤组织一般可分为三种： I 为质地坚 硬、块状、颜色鲜黄的胚性愈伤组织。 II 为质地疏松、易分散、 不分泌粘液的颗粒状胚性愈伤。 III 为柔软、水渍、形状不规则、 颜色淡白的非胚性愈伤。其中 II 是适合悬浮培养的愈伤。在进行 最初悬浮培养时，挑选那些生长力强表面有颗粒突起、疏松易 碎的胚性愈伤进行液体培养，并用镊子尽量夹碎。 ? 3. 选择合适的培养基和培养条件 ：愈伤组织培养基有时不适合 作为悬浮细胞培养基，这时需在基本培养基的基础上重新选择 培养基。选择合适的转速、培养温度、适宜的光照。 (2) 植物细胞固定化培养 ? 固定化培养技术 ： 植物细胞固定化是将植物细胞包裹 于一些多糖或多聚化合物上进行培养，并生产有用代 谢物的技术。 ? 与悬