蛋白A亲和填料NaOH耐受情况.pdfVIP

蛋白A 亲和填料在线清洗 目前，约70-80% 的抗体纯化使用Protein A、Protein G 亲和层析。 蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5 个可以和抗体IgG 分子的Fc 段特异性结合的结构域。蛋白A 作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中 的抗体分子结合，而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性，一步亲和层析就可达到超过95% 的纯度。 蛋白G 是一种源自链球菌G 族的细胞表面蛋白，为三型Fc 受体。其通过类似于蛋白A 的非免 疫机制与抗体的Fc 段结合。像蛋白A 一样，蛋白G 可以与IgG 的Fc 区域特异性结合，不同 的是，Protein G Sepharose 可以广泛、更强地结合更多类型的IgG, 多克隆IgG 及人IgG，多 种亚型的鼠IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配基脱落也相对更低。 虽然蛋白G 亲和层析应付范围比较广，但是其价格高出蛋白A 亲和层析很多，实际应用中有些 方面略输于蛋白A 亲和层析，比如收率很多时候不如蛋白A 亲和层析，还有通常洗脱pH 过低， 对抗体活性有潜在不利。而且通过改变纯化条件蛋白A 亲和层析也可以扩大应用范围，减少和 蛋白G 在这方面的差距。因此，目前抗体亲和纯化领域还是以蛋白A 亲和层析为主。 蛋白A 亲和纯化抗体采用pH3.0~4.0 缓冲液洗脱，由于早期蛋白A 亲和凝胶无法耐受NaOH， 往往也用pH3.0 左右缓冲液再生。这种方法清洗效果比较差，凝胶上会残留较多蛋白。如果取 多次纯化抗体后的凝胶直接进行SDS，就可以发现这个问题。（图1） 1 纯化40 批抗体后蛋白A 亲和凝胶 2 纯化20 批抗体后蛋白A 亲和凝胶 图1 多次纯化抗体后蛋白A 亲和凝胶上蛋白残留情况 1 2 Marker 为了抗体生产中的凝胶上蛋白残留问题，后来对蛋白 A 的进行一些改造，使得凝胶可以耐受 NaOH 的在线清洗。实际效果证明，0.1M NaOH 在位清洗15min，可以有效去除凝胶上的蛋白 残留。（图2 ） 图2 0.1M NaOH 清洗前后，蛋白A 亲和凝胶上蛋白残留情况 （凝胶为图1 中2 ） NaOH 的清洗效果除了NaOH 的浓度以外，还取决于待清洗物品与碱接触的时间长短。因此蛋 白A 亲和填料对NaOH 的耐受是凝胶的一项重要性能。 比如进口GE 凝胶MabSelect 的NaOH 耐受情况，如图3 。 图3 GE 凝胶MabSelect 的耐受情况，碱接触时间共计15min*300=75h 一些国产蛋白A 亲和填料也具有了一定NaOH 耐受能力，如图4 。 蛋白A亲和凝胶耐碱实验 120% 量 100% 载 体 抗 80% 60% 0.1M NaOH 0.5M NaOH 40% 20% 0% 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 碱处理时间（h） 图4 国产蛋白A 亲和凝胶，纯化样品为兔血清，每次使用后采用NaOH 浸泡24h 。 0.5M NaOH 处理凝胶会破坏载量，0.1M NaOH 多次循环处理都可以保持良好的凝胶纯化效果。