蛋白质的复性.pptVIP

蛋白质复性的影响因素 浓度 增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行 温度 蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（＞40℃） 蛋白质的聚集将十分严重 pH值 通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意避免 与蛋白的pI值相近 折叠促进剂 L-Arg, PEG, 去污剂, 尿素和盐酸胍 蛋白质复性 复性操作方法： 2.稀释和透析复性 稀释法：将溶液稀释，导致变性剂的浓度降 低，小分子折叠助剂浓度增大。蛋白质开始复性。 透析法：利用透析或电渗析超滤除去变性 剂，使蛋白质开始复性。 缺点：透析时间长，易形成蛋白质沉淀。 蛋白质复性 复性操作方法： 2.稀释和透析复性 有时包含体中蛋白质含有两个以上的二硫键，其中 有可能发生错误连接，在这种情况下用还原剂打断 S-S键，使其变成-SH，复性后，加入氧化剂使两 个-SH形成正确的双硫键。 还原剂：二硫苏糖醇 B-巯基乙醇 还原型谷胱肝肽 氧化剂：谷胱甘肽 空气（碱性条件下），半胱氨 酸 蛋白质复性 蛋白质复性存在问题： 蛋白质复性是十分复杂过程，其中目标产品的复性率非常低，一般不超过20%，其原因在于当变性剂稳定后，蛋白质分子可能重新聚合成二聚体，三聚体或多聚体，甚至形成沉淀物。 现有提高蛋白质复性收率有：反胶束法复性，单克隆抗体协助复性及保护复性等。 蛋白质复性 红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与 蛋白质浓度对复性的影响 蛋白质复性 红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与蛋白质浓度对复性的影响 图中有复性区、多聚体区和絮凝沉淀区。降低盐酸胍浓度或增加蛋白质浓度都易使系统进入多聚体区和絮凝区。要减少复性的损失，就必须使操作处于复性界限之上。 蛋白质复性 复性操作方法： 3.色谱复性 （1）凝胶过滤色谱为代表的非吸附型色谱。 （2）吸附型色谱复性，其中常用的金属螯合色谱复性，亲合色谱复性，离子交换色谱复性。 色谱复性法 在色谱过程中实现复性，称为色谱复性法。 近年发展十分迅速。其优点是： 色谱固定相对变性蛋白质吸附能力低， 甚至完全消除变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集，产生沉淀。提高复性质量和活性收率。 在蛋白质复性的同时可使目的蛋白质与杂蛋白质分离， 达到复性与纯化同时进行的目的。 便于回收变性剂，有利于降低废水处理成本。 适合蛋白质复性的色谱有：凝胶过滤色谱(GFC)、 离子交换色谱(IEC)、疏水色谱(HIC)、亲合色谱 (AFC). 凝胶过滤复性 凝胶过滤色谱是以溶液中分子的流体力学体积大小进行混合物分离的技术。 进行色谱柱的连续使用，提高使用效率。 溶质分子之间及溶质与分离介质之间无相互作用，活性分子不易变性，活性收率高。 凝胶过滤复性 由于上述特点，凝胶过滤色谱近年开始用于蛋 白质复性。 在凝胶过滤复性时， 先用复性缓冲液平衡凝胶 变性蛋白质溶液上样后进入柱顶， 因有高浓度 变性剂存在，变性蛋白质有一个随机构象状态和大的动力学水合半径，不能进入介质内空隙，在柱上不能保留。在用复性缓冲液洗脱时， 因变性蛋白质溶液逐步被稀释（色谱峰扩散），变性剂和蛋白质浓度降低，蛋白质分子会自发地向热力学稳定的低能态，即蛋白质的天然状态转化， 使蛋白质开始复性。 凝胶过滤复性 随时间推移，当蛋白质分子结构变得更加紧密时，蛋白质在两相中的分配系数会逐渐增加。蛋白质进入介质颗粒内部空隙后，其扩散速度减缓，从而限制了蛋白质的聚集，减少了沉淀产生。蛋白质分子大，先从柱子上洗脱，变性剂分子小，最后流出色谱柱。达到复性目的。 复性操作方法： 凝胶过滤色谱复性 通过分子筛效应将变性蛋白质与变性剂加以分离,从而使变性蛋白质进入复性溶液进行复性. 举例: 核糖核酸酶 包含体的复性 4.利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性. 一般的做法是将1-10mg的蛋白质溶入1-2mL的变性缓冲液中,使蛋白充分变性(一般在室温下数小时或过夜),然后在superdex75 HR10/30或sephacryI S系列柱上进行蛋白质分子重折叠,从凝胶过滤柱上洗脱下来的样品经超滤浓缩回收.利用此法成功地使分子内有9个半胱氨酸,分子量为50000Da的重组人ETS-1蛋白有效地复性,其构象和天然构象相同. 蛋白质复性 包含体的复性 4.利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性. 此方法的另一特点是,由多亚基组成的蛋白,变性的亚基可以在凝胶柱上缔合,正确重折叠.对于在凝胶柱上进行重折叠的机理尚不十分清楚, 一种可能的解释是在凝胶过滤柱上所进行的重折叠或分子亚基之间的缔合,是在不可逆条件下进行的,因而克服了在溶液中常规重折叠过程中所遇到的主要问题-