western-blotting(蛋白免疫印迹).pptx

;一、Western Blot 简介 二、Western Blot 一般流程 三、Western Blot 成像系统 四、Western Blot 常见问题分析 ;;一、Western Blot 优点 高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应 1-5ng中等大小的靶蛋白;;蛋白样品的制备 SDS电泳 转膜（PVDF或NC膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显影;LB： 62.5 mmol/L Tris-HCl （pH6.8 at 25℃）, 2%SDS ，10%Glycerol(甘油) ，50 mmol/L DTT(二硫苏糖醇) ；溴酚蓝 在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！ ;;蛋白质-SDS胶束的特???：;Bradford法：考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 双缩脲法：Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收 Lowly法：第一步就是双缩脲反应，即Cu2+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。;;不连续电泳系统;聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂 过硫酸铵 三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。;凝胶浓度与蛋白分离范围;;灌制分离胶;;;电泳;转膜;膜的选择;;转膜;半干转移系统;封闭;一抗、二抗孵育;二抗与底物反应显色;洗脱抗体;三、显色;Tanon 5200性能特点;Tanon 5200软件特点;胶不平？ 凝胶漏液？;?条带比正常的窄？ ?“微笑”或“倒微笑”条带？;? 凝胶肿胀或卷曲？ ? 条带歪斜或漂移？ ? 单个或多个白点？ ? 转膜缓冲液过热？;1. 膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交叉反应 5. 抗体浓度过高;