试验三病原细菌的鉴定与药物敏感性大.ppt

实验三 病原细菌的分离、鉴定与毒力分析 一、实验目的 1 ．掌握无菌操作条件下致病菌的分离方法与程序； 2 ．了解细菌鉴定的方法，熟悉细菌常用的生理生化反应及原理。 二、实验内容 1. 平板划线法分离病原细菌； 2 ．病原细菌的形态与生理生化鉴定； 3 ．病原细菌的人工感染（课外选作实验）。 三、主要仪器及试材 ? 显微镜，解剖镜，解剖用具，包括解剖盘、解剖刀、解剖针、大小手术 剪、大小镊子，培养皿、载玻片、盖玻片、纱布等。 ? 蒸馏水、鱼用生理盐水， 70% 的乙醇、 BHI 培养基、生化管等。 ? 人工感染嗜水气单胞菌的鱼，未知病原菌感染的鱼 （剪掉部分背鳍或腹 鳍作为标记 ) 。 四、实验方法与步骤 （一） 病原细菌的分离 1 ．无菌操作打开病鱼的腹腔： 2 ．细菌划线接种： 3 ．培养与观察： （二）病原细菌的革兰氏染色 分别取嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、链球菌和个人分离的未知菌株进 行革兰氏染色，记录结果。 四、实验方法与步骤 （三）病原细菌的生理生化鉴定 分别测定 分离菌 和 嗜水气单胞菌 的 12 种生化指标：氧化酶，吲哚实验， VP ， H 2 S ，鸟氨酸脱羧酶，精氨酸双水解酶性，七叶苷，赖氨酸脱羧酶，山梨醇， 蔗糖，纤维二糖，明胶。 取生化管于距离内容物上方 2cm 处用砂轮割开，迅速于酒精灯火焰消毒， 然后接种菌株，以 封口膜 或液体石蜡封口，置35℃孵育，依据说明书进行。 四、实验方法与步骤 （四）病原细菌的毒力分析 1 ．实验鱼： 实验环境下暂养 7-10 天。每组不少于 50 条 ，设不少于 3 个平行重复。 2 ．菌悬液制备： 液体培养基增殖，用无菌生理盐水悬浮。经计数后采用等对数间距设计约 5 个感染剂量 进行感染试验。对照组以无菌生理盐水。 3 ．注射方法： 感染前实验鱼用 MS-222 麻醉，用湿毛巾裹住鱼体头部。 （ 1 ）腹腔注射：腹鳍基部无鳞片处。 （ 2 ）肌肉注射：背鳍前端与侧线之间的中部区域。 四、实验方法与步骤 （四）药物敏感性实验 （一）纸片扩散法 1. 原理： 含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物 吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成 递减的浓度梯度 ，细菌的生长 被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，即抑菌圈愈 大，药物敏感性越强。 四、实验方法与步骤 2. 实验操作 1 ）倒平板 2 ）菌悬液制备： 挑取斜面中菌苔于少量生理盐水中制成细菌悬液，将菌液浓度调到 1*107 cfu/mL 。以玻璃刮铲将 0.1mL 细菌悬液均匀涂布于平皿培养基表面； 3 ）贴片： 将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏 片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了能准确观察结果，要求药敏片能有规 律的分布于平皿培养基上（在平皿中均匀贴四片）； 4 ）培养： 28℃温箱中培养 24 h ，记录结果； 四、实验方法与步骤 结果观察：抑菌圈直径大小与药物浓度、细菌浓度有直接关系，观察抑菌圈的有无。若有抑 菌圈，则测量抑菌圈直径；若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。 抑菌圈直径≥ 15mm 高度敏感 抑菌圈直径 10-15mm 中度敏感 抑菌圈直径≤ 10mm 低度敏感 无抑菌圈 不敏感或耐药 氟： 75 μ g/mL ；恩： 5 μ g/mL 磺： 300 μ g/mL ；青： 10IU/mL 标记分区 底部观 磺 氟 靑 嗯 四、实验方法与步骤 （二）肉汤试管稀释法 1. 原理： 以肉汤液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后接入待检菌，定量测 定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度（ MIC ）。 2. 实验操作 1 ）菌液准备： 挑取金黄色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理盐水中制成细菌悬液， 将菌液浓度调到 1*107cfu/mL 备用； 四、实验方法与步骤 2 ）抗菌药物稀释（硫酸庆大霉素注射液）： 配制药物原液浓度为 8 万 IU/mL （ 80mg/mL ）， 0.45 μ m 滤器除菌。 ①准备 11 支 2 mL 无菌 EP 管编号 0~10 排好，在 0 号管和 1 号管中加 1.8 mL 无菌生理盐水， 2~10 号管加 1 mL ； ②吸取 0