医学遗传学课件：第14章 遗传病的诊断.ppt

3.注意新的基因突变 没有家族史的先证者应考虑是新的基因突变。 例如：假肥大型肌营养不良（DMD）约有1/3的病例为新的基因突变引起的。一般认为是由于患者母亲卵子形成过程中X染色体上DMD基因突变所致。 2. Y染色质检查 利用荧光染料盐酸喹吖因等染料进行Y染色质的数目检查。这种检查适用于具有一个或一个以上Y染色体的个体或细胞群。如正常男性只有一个Y小体，而XYY男性有2个Y小体。 可用于性别的鉴定。 生化检查主要是对由于基因突变引起的蛋白质和酶结构或功能活性的检测。此外还包括反应底物、中间产物或终产物和受体的结合能力检查。该方法特别适用于分子病、先天性代谢缺陷、免疫缺陷等遗传病的检查。 该方法所用的材料主要有血液、活检组织、尿、粪、阴道分泌物、脱落细胞和培养细胞等。 4．曾生育过先天畸形（尤其是神经管畸形）的孕妇； 5．有原因不明的自然流产，畸胎，死产及新生儿死亡的孕妇。 6. 有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。 杂交方法： 斑点杂交 Southern杂交 Northern杂交 Western印迹杂交 原位杂交 寡核苷酸探针杂交 当致病基因的某种突变类型与发病有直接的因果关系,或者对致病基因以及分子机制已完全了解,或者对致病基因以及分子机制部分了解但已知其中规律,可应用此途径。 连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。RFLP、VNTR、SSCP、AMP－FLP等技术均可用于连锁分析。 （1）PCR-ASO （PCR/等位基因特异性寡核苷酸探针杂交） 根据已知基因突变位点的碱基序列，设计和制备只有几十个核苷酸的ASO探针，检测被检DNA中的同源序列。 ASO探针杂交原理示意图 （2）PCR-RFLP （PCR-限制性片段长度多态性连锁分析） 方法包括： ①PCR：即利用一对或数对 特异性引物，将目标DNA扩 增；②酶切：即利用某些限 制性内切酶消化PCR产物， 如PCR产物中含有相应的酶 切位点序列，DNA链则被切 开；③电泳：即利用琼脂糖 凝胶或聚丙烯酰胺凝胶分离 酶切后的PCR产物，根据电泳 图谱判断结果。 （3)RT-PCR(反转录PCR） 从组织中提取总RNA，经反转录酶合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。 可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。 (4)多重PCR 多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。已经应用到DNA检测的许多领域，包括基因缺失、基因突变和基因多态性，以及基因定量检测和逆转录PCR。 (5)PCR-SSCP（PCR-单键构象多态性分析） 1989年，Orita等建立的PCR产物单链DNA凝胶电泳技术。 1 2 3 4 5 a b 1：正常人 2,4,5：纯合体患者 3：杂合体(2的弟弟) 左为泳动变位模式：a 正常人；b 纯合体患者 PCR-SSCP GAA→GAG TGT→TAT CTC→CAC (6)PCR-DGGE （PCR产物变性梯度凝胶电泳） 将PCR产生的双链DNA在含尿素和甲酰胺浓度递增的变性胶上电泳，随着DNA迁移，DNA片段上低温解链区的双链渐渐先后分开,这部分的解链导致DNA迁移速度下降。观察产物的迁移率即可判断是否存在变异。 只要有一个碱基突变，即可用DGGE方法检测。 Maxan和Gilbert首先建立了化学方法，Sanger建立了DNA测序的酶学方法。 最新的DNA自动测序法以不同荧光色素标记的四种不同脱氧核苷酸为原料进行酶促合成反应，经过凝胶电泳分离，应用激光分析及计算机处理就能直接读出碱基顺序。极大地推进了生命科学的发展和人类基因组计划的进程，而且测序的长度可以达到1000bp以上。 3.DNA测序技术( DNA sequencing） DNA测序（DNA Sequencing)是检测未知突变和已知突变基因的最基本和最重要的实验手段。 DNA荧光自动测序法示意图 　 基因芯片技术是近年 来发展十分迅速的大规模、 高通量分子检测技术