肝细胞核因子4α(HNF4α)诱导肝细胞功能的体外和体内研究.doc

肝细胞核因子 4α（HNF4 α）诱导肝细胞功能的体外和体内 研究 肝细胞核因子 4 诱导肝细胞功能的体外和体内研究 内容摘要目的： 首先比较不同肝细胞、 胚胎干细胞 embryonic stem cell，ES 以及肝肿瘤细胞． HNF4 α 基因和肝细胞相关功能基因的表达情况， 然后选择 HNF4 α作为外源目的基因，利用 AdEasy 系统构建表达 HNF4 α的重组复制缺陷型腺病 毒 AdHNF4 α ，通过病毒体外感染人肝肿瘤细胞株 HepG2 Hep3B 以及小鼠 ES 细胞，上调目的基因在细胞内表达，分别观察 HNF4 α 基因上调对其生物学功能的影响；并应用 HNF4 α基因修饰 HepG2 细胞治疗急性肝功能衰竭小鼠，初 步观察小鼠生存率和肝功能改善情况。实验方法：一、比较 不同肝细胞、肝肿瘤细胞以及 ES 细胞 HNF4 α 和肝细胞相关 功能基因的表达 RT-PCR 检测人正常成熟肝细胞、人肝肿瘤 细胞株以及人胎肝细胞株 HNF4 α基因和肝细胞相关功能基 因的表达；同法检测小鼠正常成熟肝细胞、不同发育阶段胎 肝细胞、小鼠 ES 细胞 HNF4 α 基因和肝细胞相关功能基因的 表达。二、重组复制缺陷型腺病毒 AdHNF4 α 构建及鉴定将 pAdTrack-CMV 与获得的 HNF4 α cDNA 片段均经 Bgl Ⅱ、 EcoRⅤ酶切后连接，获得质粒 pAdTrack-CMV-HNF4 α ，将 Pme Ⅰ酶切线性化的 pAdTrack-CMV-HNF4 α 与 pAdEasy-1 质粒共转化 BJ5183 感受态细菌同源重组， PacⅠ酶切筛选出 pAdHNF4 α，并测序验证目的基因序列的正确性。 PacⅠ酶 切线性化的 pAdHNF4 α 转染 293 细胞，反复感染、 冻融 293 细胞，获得 AdHNF4 α ，以同样方法获得对照病毒 AdGFP 。将 AdHNF4 α 体外感染胎肝细胞株 L02 ，以 RT-PCR 和 Western blot 检测 HNF4 α 在肝细胞中的表达。三、外源导入 HNF4 α对人肝肿瘤细胞生物学特性影响人肝肿瘤细胞株 HepG2 和 Hep3B 均以 5× 10/皿接种于六孔板，分别将病毒 以感染复数  multiplicity of infection  ， MOI40  、 50  感染细胞， 24 h  后更换含  10%胎牛血清的新鲜  DMEM  培液， 3 d 后观察 GFP 表达，RT-PCR 和 Western blot 检测 HNF4 α表达，RT-PCR 检测肝细胞相关功能基因的表达，流式细胞仪测定肝肿瘤细 胞凋亡率。 四、外源导入 HNF4 α 对小鼠 ES 细胞生物学特性 影响首先制备小鼠原代胚胎成纤维细胞 primary mouse embryonic fibroblast  ， PMEF  滋养层，将小鼠  ES  细胞接种于 其上进行培养和传代；将  ES  细胞以密度为  2x10/ml  接种于 培养皿中悬浮培养，第  5 d  将形成的胚体以  30～ 40  个 /皿接 种于  0.1%明胶包被过的  35 mm  组织培养皿使其贴壁诱导分 化，培养液中分别加入  AdHNF4  α 或对照病毒  AdGFP ，在分 化过程中观察 GFP，并添加病毒维持 HNF4 α 表达，免疫细胞化学法检测 CK8 、CK18 、AFP 以及 ALB 的表达， RT-PCR 检测肝细胞相关功能基因的表达， 过碘酸 -Schiff 氏法 Periodic Acid-Shift  ，PAS  法检测糖原合成，吲哚氰绿  Indocyanine Green，ICG 吸收染色实验检测细胞代谢 ICG 功能。五、HNF4 α基因修饰的移植肝细胞治疗小鼠急性肝功能衰竭将 HNF4 α基因修饰的 HepG2HepG2-HNF4 α 以 4× 10/只通过尾静脉导入 CCl 诱导的急性肝功能衰竭小鼠体内， 通过检测小鼠血 清总胆红素和血糖，观察小鼠的一般情况和生存率等指标， 评估 HNF4 α 基因修饰的 HepG2 对实验性急性肝功能衰竭的 治疗效果。六、统计学处理数据采用 SPSS12.0 统计软件包进行分析，灰度比值采用 One-Way ANOV A 分析，方差非齐 性则采用非参数检验； P<0.05 为具有显著性差异， P<0.01 为具有非常显著性差异。实验结果：一、在不同分化水平的肝 细胞中 HNF4 α 表达有明显差异。 1.RT-PCR 检测人正常成熟肝细胞、人肝肿瘤细胞株 Huh-7 、 Hep3B 、 HepG2、人胎肝细胞株 L02 以及 WRL-68 的