PCR扩增目的基因-.ppt

任务二：PCR扩增目的基因 一、实验目的 1、掌握PCR扩增DNA的技术与原理 2、学习PCR扩增仪的使用 二、实验原理 聚合酶链式反应是一种体外DNA扩增技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等特点。 PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片段和与其两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增序列片段的特异性和片段长度。 三、实验仪器 PCR扩增仪 台式高速离心机 移液器 高压灭菌后的Eppendorf管（0.5mL ） 电泳仪 四、材料与试剂 1、模板DNA（0.1μg/μL）：用牙签挑取单 菌落悬浮到50μL的裂解液中（1%TritonX- 100，20mmol/LTris-HCLpH8.2，2mmol/L EDTA），95℃温浴10min，10000r/min 离心5min，取2μL上清液用于总体积50μL的PCR反应。 五、实验操作 六、注意事项 1、PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有 必要进一步优化反应条件，包括改变退火 温度和时间，调整Mg2+浓度等。 2、PCR反应特异性强，引物浓度、TaqDNA聚合酶和dNTP的量不宜过多。 3、引物设计要合理。 * 标准的PCR过程分为三步： 　　1.模板变性（92℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 　　2.低温退火（37℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 　　3.延伸（72℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。 2、TaqDNA聚合酶（5U/μL），10×扩增 缓冲液，dNTP（1mmol/L）：购买。 3、引物（100pmol/L）：设计并合成与目的DNA两侧互补的引物。 1.准备PCR反应溶液 （1）按序将如下成分混合置于Eppendorf管内 a.10×扩增缓冲液 10μL b.4×dNTPs 8μL c.引物11μL d.引物2μL e.模板DNA 1μL（10ng） f.TaqDNA聚合酶μL （2.5U） 加水至Ｖ终＝100μL （2）手指轻弹Eppendorf管底部 离心2s （3）加石蜡油50μL封住溶液表面 2.PCR扩增反应 加好样的Eppendorf管置于PCR扩增仪内 变性：95℃ 5min 95℃1min 退火：55 ℃45s 延伸：72 ℃1min 重复循环30次 循环结束后72 ℃延伸8min 反应完毕，取样置-4 ℃待用 3.结果观察 取样进行琼脂糖凝胶电泳 溴化乙锭（EB）染色 观察DNA条带 高度灵敏的荧光染色剂 染色效果好 操作方便 稳定性差 强致癌剂 中度毒性 Thank you ! *