1387编号微生物计数方法.pdfVIP

微生物的显微直接计数法 一、实验目的 了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。 二、实验原理 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体 较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。 而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有 4 条槽而构成 3 个平台。中间的平台较宽， 其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图 21-1），计数区的刻度有 两种：一种是计数区分为 16 个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成 25 个小方格； 另一种是一个计数区分成 25 个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成 16 个小 方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由 400 个小方格组成。 2 2 计数区边长为 1mm，则计数区的面积为 l mm ，每个小方格的面积为 1/400mm 。盖上盖玻片后， 3 3 计数区的高度为 0.1mm，所以每个计数区的体积为 0.1mm ，每个小方格的体积为 1/4000mm 。 使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或 每克样品）中微生物细胞的数量。 3 3 已知：1mm 体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm 3 3 3 6 所以：1mm 体积应含有小方格数为 1000mm /1/4000mm =4×10 个小方格，即系数 K=4× 6 10 。 因此：每ml 菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍 数（d） 三、实验器材 1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。 2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。 四、实验方法 -2 1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到 10 ），以每小格的菌数可数为 度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘 摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用 吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区 两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使 产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再 转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强 度。 5．计数时若计数区是由 16 个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的 4 个大方格（即 100 小格）的菌数。如果是 25 个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外， 还需数中央 l 个大方格的菌数（即 80 个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上 线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。 6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复 计数 2—3 次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N）， 按公式计算出每 ml （g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。 7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免