免疫共沉淀实验原理与方法.pdf

免疫共沉淀实验原理及方法 免疫共沉淀（ CoIP ）概述及原理 免疫共沉淀 （Co-Immunoprecipitation ，CoIP ）是研究蛋白 - 蛋白间相互作用的经典方 法，属于 免疫沉淀技术 的一类， 常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。 免疫共沉 淀的设计理念是， 假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员， 那么利用这种蛋白 的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中 “拉 ”下来（常说的 “pull-down”），进而可 以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。 免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一 是天然状态，第二是蛋白复合物。 免疫共沉淀的优势： 与其他研究蛋白质相互作用技术（如 GST-Pull down 、酵母双杂交等）相比，免疫共沉 淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合， 避免了人为的影响， 因此符 合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。 免疫共沉淀的局限性和注意事项： 1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的 蛋白组分很可能检测不到； 2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种 pull-down 抗体，无论怎么增加抗体浓度， 也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来， 如有必要最好使用多种不同抗体分别进行 CoIP ； 3. 由于检测的是天然状态， 因此在不同的时间和不同的处理下， CoIP 拉下来的蛋白复 合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大； 4. 如果使用 Western Blot 的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白， 则需要在试验前进 行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题， 但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高； 5. CoIP 鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用， 进一步区分还 需要进行 GST-Pull down 等实验检测； 6. 为了保证 CoIP 实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行 CoIP 实验， 并且结果应该能够彼此验证， 因为原则上使用复合物的任一成员进行 CoIP 都会 得到其他所有成员 [1] 免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）： 1. 用预冷的 PBS 洗涤细胞两次； Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times. 2. 加入预冷的 RIPA 裂解缓冲液（ 107 细胞加入 1ml ）； Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells). 3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养介质上刮离，并转移到干净的 1.5EP 管中。并置于低 速摇床， 4℃ 缓慢晃动 15min ； Scrap cells off to clean 1.5ml eppendorf tubes with a clean, cold scraper. Put them on a low-speed rotating shaker for 15 min at 4 ° C. 4. 4 ℃， 14000g 离心 15min ，立即将上清转移到一个新的离心管中 Centrifuge at 14,000 g 4 ° Cfor 15min, transfer