哺乳动物物细胞表达重组蛋白.ppt

哺乳动物细胞培养制备重组蛋白质药物 按照宿主细胞的类型,可将基因表达系统分为 ●原核表达系统 酵母表达系统 植物表达系统 昆虫表达系统 哺乳动物细胞制备的蛋白质药物质量高, 与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物 学功能 发展历史和现状 ●1987年FDA批准了基因泰克公司生产的组织型纤溶酶原激活 剂(tPA 世界上第一个哺乳动物细胞制备的重组蛋白质药物 标志着哺乳动物细胞制备重组蛋门时代的到来 我国从2000年开始逐渐发展了该项技术,虽然起步较 晚,基础较差,但经过努力实现了该项技术的突破 经过20多年的发展,哺乳动物细胞制备重组 蛋白技术发生了巨大的变化。主要表现在 (1)细胞培养时间延长,由过去的7天延长至21天 (2)细胞密度增加, 过去:1-2X106细胞/亳升, 现在:1-1.5X107细胞/亳升 (3)产量增加, 过去:10—20pg重组蛋白/细胞/天, 50100mg重组蛋白/升, 现在:5090pg重组蛋白/细胞/天 1-5g重组蛋白/升。 哺乳动物细胞大规模生产重组蛋白的关键之处 ●表达载体 改进表达载体,提高表达水平和产量 分泌表达 下游纯化 ●宿主细胞新型细胞株的建立 培养工艺 真核表达载体 人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体,含 原核DNA序列:大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因,便于 载体在原核细胞中扩增和大量制备 转录相关元件:哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子 元件,以及终止子和加poyA信号序列。。 翻译相关元件:有效的mRNA翻译信号 其它:视实验需要加入标志基因、内含子、内部核糖体进入 位点等。 三 TOPO BGH DA pCDNA3.1/V5 a His-TOPO 5.5kb See polylinker sequence puC ori- on the web Represents covalently bound topoisomerase I 真核表达载体-启动子 外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关, 主要是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。 人巨细胞病毒的早期基因启动子和增加子( promoter / enhancer)是最常用的启动子。 高效启动子的发现和改构 内含子 某些内含子有重要的基因功能调控序列,目的基因以基 因组形式克隆入载体能得到高表达 为增加转录产物的稳定性表达载体中一般含有天然的 或人工合成的内含子序列。 转录终止序列 真核基因的 hnRNA的加工过程需要 PolyA信号,在目的基 因3端加上 polyA表达水平提高10倍以上。SV40的早期 和晚期 polyA BarIl Sy40 Enhancer Early Promoter Bs8T7↓ XhoI884 Intron Bs9B1/ECoRI 689 Mu I Vector Xba 707 (3632p) Sall713 Amp Sv40 Late AccI714 poly(A] Smal720 6sz724 Nt724 f1 ori BamHI