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亚硫酸氢钠测序法 (bisulfite genomic sequencing) 直接测序法是建立在 MSP基础上进一步深入研究 CpG岛各个位点甲基化情况的方法 . 重亚硫 酸盐使 DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶 , 而甲基化的胞嘧啶保持不变 , 行 PCR扩增 ( 引物设计时尽量避免有 CpG,以免受甲基化因素的影响 ) 所需片段 , 则尿嘧啶全部转 化成胸腺嘧啶 . 最后 , 对 PCR产物进行测序 , 并且与未经处理的序列比较 , 判断是否 CpG位点发 生甲基化 . 此方法一种可靠性及精确度很高的方法 , 能明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲 基化状态 . 在寻找有意义的关键性 CpG位点上 , 有其他方法无法比拟的优点 . 测序法以 CpG岛 两侧不含 CpG 点的一段序列为引物配对区 , 所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列. 它的不足是耗费时间和耗资过多 , 至少要测序 10 个以上的克隆才能获得可靠数据 , 需要大量 的克隆及质粒提取测序 , 过程较为繁琐、昂贵 . 第一部分 基因组 DNA的提取 . 这一步没有悬念 , 完全可以购买供细胞或组织使用的 DNA提取试剂盒 , 如果实验室条件成熟 , 自己配试剂提取完全可以 .DNA 比较稳定 , 只要在操作中不要使用暴力 , 提出的基因组 DNA应 该是完整的 . 此步重点在于 DNA的纯度 , 即减少或避免 RNA、蛋白的污染很重要 . 因此在提取过程中需使用 蛋白酶 K 及 RNA酶以去除两者 . 使用两者的细节： 1：蛋白酶 K 可以使用灭菌双蒸水配制成 20mg/ml； 2： RNA酶必须要配制成不含 DNA酶的 RNA酶 , 即在购买市售 RNA酶后进行再处理 , 配制成 10mg/ml. 否则可能的后果是不仅没有 RNA,连 DNA也被消化了 . 两者均于 -20 度保存 . 验证提取 DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算 OD比值； 2： 1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳 . 我倾向于第二种方法 , 这种方法完全可以明确所提基因组 DNA的纯度 , 并根据 Marker 的上样 量估计其浓度 , 以用于下一步的修饰 . 第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组 DNA 如不特别指出 , 所用双蒸水（ DDW）均经高压蒸汽灭菌 . 1：将约 2ugDNA于 1.5mlEP 管中使用 DDW稀释至 50ul ； 2：加 5.5ul 新鲜配制的 3M NaOH； 3： 42 ℃水浴 30min； 水浴期间配制： 4： 10mM对苯二酚（氢醌） , 加 30ul 至上述水浴后混合液中； （溶液变成淡黄色） 5： 3.6M 亚硫酸氢钠（ Sigma,S9000 ）, 配制方法： 1.88g 亚硫酸氢钠使用 DDW稀释 , 并以 3M NaOH滴定溶液至 PH 5.0, 最终体积为 5ml. 这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶 , 但加入 NaOH后 会慢慢溶解 , 需要有耐心 .PH 一定要准确为 5.0. 加 520ul 至上述水浴后溶液中 . 6： EP管外裹以铝箔纸 , 避光 , 轻柔颠倒混匀溶液 . 7：加 200 ul 石蜡油 , 防止水分蒸发 , 限制氧化 . 8： 50℃避光水浴 16h. 一般此步在 4pm开始做 , 熟练的话不到 5pm即可完成 , 水浴 16h 正好至次日 8am以后收 , 时间 上很合适 . 这一步细节： 1：基因组 DNA的量不需十分精确 , 宁多勿少 , 因为在以后纯化回收步骤中会有丢失 , 且此方法 修饰最多可至 4ug. 2：所有试剂均须新鲜配制 , 所以配液的技术要过关 , 既要快 , 又要精确 . 3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性 , 一定用碱将 PH调制 5.0, 否则 PH不合适会影响后续纯化吸收 . 4：水浴最好达 16 小时 , 虽可以短至 8 小时 , 但后者修饰会有不完全 . 第三部分 修饰后 DNA纯化回收 EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的 . 将移液器枪头伸入石蜡油层下 , 先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出 , 然后吸取混合液至一洁净 1.5mlEP 管中 . 2：以下使用 Promega Wizard Cleanup DNA 纯化回收系统（ Promega,A7280 ） 1） 70℃水浴预热 DDW；配制 80%异丙醇； 2）加 1ml Promega’s Wizard DNAClean -up resin, 轻柔颠倒混匀 , 使 DNA充分与树脂结合； 3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓 , 如果有真空负压吸引器 , 使用起来很方便；如果没 有