抑制差减杂交技术原理及常见操作的的结果分析.ppt

抑制差减杂交技术原理 及常见操作结果分析 抑制 LDDIOSSI ation,SH是一种 效 因的新技 目前,该技术在分子生物学 到了广泛的应用。本文对SSH 减cDNA文库构建的技术流程 及优缺点等作了较全面的介绍,可为研究者 提供参考 生物的生长、发育、代谢、繁殖和死亡等生命活动 都是由不同的基因表达来控制的,一般认为某一时期的表 达基因的数量约为全部基因的1.5%,所以基因的表达具有 时空性和组织特异性。研究基因的差异表达,可探究造成 生物细胞表型差异的遗传原因,提供研究复杂生命过程的 基本信息。 研究差异表达基因的方法很多,如组织或特异时期的 同工酶谱分析、差减杂交 (subtractivehybridization,SH、 mRNA差别显示法 (differentialdisplay,DD)、代表性序列差 别分析( representationaldifferenceanalySis, RDA和抑制差减 杂交技术( suppressionsubtractivehybridization, SSH 近年来抑制差减杂交技术(S以其高效便捷和低假 阳性的优越性受到广大研究人员的重视,已在分子生物学 的各个领域得到了广泛的应用。 1抑制差减杂交技术原理 抑制差减杂交技术(SSH)是由 Diatchenko等建立的以抑制性PCR和 DNA差减杂交方法相结合的方法。其 依据的主要技术有两 经抑制差减杂交后的cDNA群体不 仅富集了差异表达基因(目的基因,而 且目的基因间丰度的差异经过均等化 作用已基本消除使消减后的cDNA群60 体为丰度一致的目的基因群体。 SSH的基本过程 抽提两种不同来源组织的mRNA(和,反转录成 cDNA,用4碱基识别酶(RsaD或Hac酶切两种cDNA产生平端片 段,将 -tester DNA分成均等的两份,分别接上 dapter和 adapter2两 种接头,并与过量的经Rsa消化的 driver样本变性后退火杂交 第一次杂交后有4种产物a是单链 testercDNA;b是自身退火的 testercDNA双链;c是 tester和 driver的异源双链;d是 drivercDNA 根据复性动力学原理,丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交 速度快于丰度低的单链cDNA,因此第一次杂交使得丰度有差 的cDNA的单链分子的相对含量趋向一致。 混合两份杂交样品,同时加入新的变性 driver cDNA进行第 dp2的部分特异序列进行PR打增只有含不同接头的双链6 DNA分子(e)才可进行指数扩增,扩增产物即为目的片段。利用 adapter上的酶切位点可进行克隆、测序等 T1DA”A.当p1ar1 EPiN? Ne . in Tp口tAen当"1 件E4 -l urinar o simplif and 2抑制差减杂交技术流程及常见操作结果分析 2.1RNA的抽提和mRNA的分离纯化 对植物材料而言RNA的抽提一般有两种方法,其一是 异硫氢酸胍法,其二是酚/SDS法。提取的RNA的质量, 可通过1×TAE琼脂糖胶电泳和分光光度计检测。对于 高质量的RNA,胶电泳呈三条带28s、18s和5,点样孔干 净,且三条带的亮度呈:28>18>5s(图2) 图2植物组织RNA的凝胶检测 如果点样孔不干净,则说明有DNA、蛋白质或 多糖污染,应进一步纯化。如果亮度呈:28<18s<5, 则说明RNA发生了降解。RNA的纯度还可以通过 分光光度计测定在26nm和28nm下的OD值来确定 如果在260nm和280nm下的OD值之比为1.7~2.0,说 明RNA较纯如果比值小于1.7~20,说明样品中有 蛋白质或多酚污染。 在分离mRNA之前,首先测定RNA在260mm下的 OD值,计算RNA的浓度。然后按 Oligotex mRNAS pin-Column试剂盒从总RN△中分离mRNA。mBNA 分离出来后,与分离剩余物同时点样,进行1×TAE 琼脂糖胶电泳,可以见到分离的mRNA在18和28s 之间呈较亮的 smear;而剩余物则表现为18s和28s两 条亮带。 22cDNA的合成 DNA两条链的合成用 Clontech pcr SelectcDNA SubtractionKit(试剂盒)来完成 2.3Rsa消化和 adapter、 adapter2R的连接 用RsaI酶切合成的cDNA可产生短的双链平末端cDNA 片段。检测酶切效果。取0.24g未经酶切的cDNA和5u用 RsaI消化的cDN△进行琼脂糖胶电泳(19%),前者为接近点样 孔的高分子量带,后者为0.1~2kb之间的 Smear。如果用RsaI 消化后的cDNA未变小或仍大于2kb,说明酶切效率不高,司 能是cDNA中不含有Rsa的酶切位