【采矿课件】实验三十氧化亚铁硫杆菌的生理研究.docxVIP

实验三十 氧化亚铁硫杆菌的生理研究 一、目的要求 1．了解氧化亚铁硫杆菌 (T.f) 的特性； 2．掌握 T.f 菌生长曲线测定的方法； 3． T.f 菌氧化生理研究。 二、实验原理 氧化亚铁硫杆菌 (Thiobacillus ferrooxidans ，简称 T.f 菌 )是一种革兰氏阴性菌，具有化能自养、好气、 嗜酸、 适于中温环境等特性，广泛存在于酸性矿山水及含铁或硫的酸性环境中。 像光合作用一样， T.f 菌能固定 CO2 作为合成细胞的碳源 ;与光合作用不同之处是 T.f 菌利用环境中无机物的氧化获取生长繁殖所需的能量。 通过氧化磷酸化作用， T.f 菌从 2 价铁 (液相游离态或结晶状态 )获得电子，将 2 价铁氧化为 3 价铁离子， 所得电子经一系列传递过程合成能量货币 ATP，最后将电 子传递给 O2。宏观反应可表示为 + 2 + +1/20 3+ 2 2 T.f 菌能够浸出矿物中的有价金属，人们利用这一现象已开始应用于矿业冶金， 并提出了细菌浸出的直接间接作用机理。 直接作用指附着细菌直接催化矿物氧化分 解，从中直接得到能源和其它矿质营养元素。 间接作用指依靠细菌的代谢产物 —— 硫酸亚铁的氧化作用， 细菌间接地从矿物中获得生长所需的能源和基质。 具体来说，直接作用和间接作用发生如下化学反应： 直接作用： MS+2O 2 ——→M 2++SO 42- 间接作用 ： 4Fe2++4H + +O 2 ——→ 4Fe3++2H 2 O MS+2Fe 3+——→M 2++2Fe2++S0 1 / 4 2S0+3O 2 +2H 2O——→ 2H2SO4 在此过程中 T.f 菌充当催化剂的角色。 酸性环境中无催化剂条件下， 空气氧化 Fe2+ 进行的很慢。 T.f 菌的参与可使反应速度提高 105-106 倍。 亚铁滴定测定法：亚铁测定用重铬酸钾标准滴定法，样品用量 2ml ，移入 20ml 的硫磷酰强酸性溶液中，然后用 1.755g /L 的重铬酸钾溶液进行滴定，也可视样品 中亚铁浓度将滴定药剂进行稀释后再行滴定，前者滴定 1ml 即相当于含有亚铁 0.002g ，后者则再除以稀释倍数；指示剂为 0.2%的二苯胺硫酸钠，当变为紫色时 即为终点；硫磷酰配比为浓硫酸 150ml ： 150ml 浓磷酸： 700ml 蒸馏水。 pH 的测定：用 pH 计。 三、菌种及仪器 菌种：氧化亚铁硫杆菌（ Thiobacillus ferrooxidans ） 主要仪器：烧杯（ 1000ml 、500ml ）、三角瓶（若干） 、药匙、电子天平、玻璃棒、 电炉、 PH 试纸、 2ml 移液管、摇床、洗瓶、酸性滴定管、小烧杯（ 10ml ）血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。 实验药品及试剂： (NH 4)2SO4、KCl 、K 2HPO4 、MgSO4·7H2Ｏ、Ca(NO3)2 、1:1H 2SO4 溶液、蒸馏水、 FeSO4·7H 2Ｏ 、硫磷酰强酸性溶液（强硫酸 150ml+ 强磷酸 150ml+ 蒸馏水 700ml ）、 1.755g /L 的重铬酸钾溶液、 0.2% 的二苯胺硫酸钠。 四、实验步骤： 培养基的配置： (NH ) SO 3.0(g/L) 、 KCl1.0(g/L) 、 K HPO 0.5(g/L) 、 MgSO ·7H 2 Ｏ 0.5(g/L) 、 4 2 4 2 4 4 Ca(NO ) 0.01(g/L) ，按此配方加蒸馏水配溶液 1000ml, 用 1:1H SO 调 pH 约 2.5。 3 2 2 4 接种 向 250ml 三角瓶内加入 100ml 培养基， 121 ℃ 灭菌 20min ，冷却后加入 FeSO4·7H 2O44.7(g/L) ，接种。接种量为 5%（ V/V ），于 30℃ 、150rpm 恒温振荡 器培养。 亚铁氧化率测定 2 / 4 每隔 6 小时取培养液 2ml，加入 20ml 硫磷酸和 5-8 滴二苯胺硫酸钠指示剂，然 后用重铬酸钾溶液滴定。当指示剂变为紫色即为终点。记录下滴定 ml 数，每 ml 相当于 0.002g 亚铁。 生长曲线测定 每隔 6 小时取培养液 5ml 加入试管， 加草酸铵结晶紫 1ml ，混匀用血球计数器显 微镜下计数蓝色活菌数，重复 5 次，具体步骤如下： a.菌悬液制备 :以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。 b.镜检计数室 :在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗， 吹干后才能进行计数。 c.加样品 :将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片， 再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴， 让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。 取样时先要摇匀菌液；