生化分离与纯化技术 实训项目 胰凝乳蛋白酶的制备.pptVIP

胰凝乳蛋白酶的制备 胰凝乳蛋白酶的制备 胰凝乳蛋白酶的制备 产品简介 一、产品简介 胰凝乳蛋白酶chymotrypsin 又叫糜蛋白酶，是一种典型的丝氨酸蛋白酶 ，脊椎动物的消化酶。 EC 3.421.1。在胰脏中以酶前体物质胰凝乳蛋白酶原的形态生物合成，随胰液分泌出去。在小肠受到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的一定的分解，转变成活性的胰凝乳蛋白酶。属于肽链内切酶（从肽链中间特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断； 作用位点 ——中间特殊的肽链位点），主要切断多肽链中的芳香族氨基酸残基的羧基一侧。 胰凝乳蛋白酶的制备 实训目标 1.掌握盐析法分离酶的基本原理和操作； 2.掌握结晶的基本方法和操作； 3.学习胰凝乳蛋白酶制备的方法。 胰凝乳蛋白酶的制备 实训原理 蛋白质分子表面带有一定的电荷，因同种电荷相互排斥，使蛋白质分子彼此分离；同时，蛋白质分子表面分布着各种亲水基团，这些基团与水分子相互作用形成水化膜，增加蛋白质水溶液的稳定性。如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐，蛋白质分子表面的电荷被大量中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子相互聚集而沉淀析出，这种现象称为盐析。由于不同的蛋白质分子表面所带的电荷多少不同，分布情况也不一样，因此不同的蛋白质盐析所需的盐浓度也各异。盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合液中的各个成分分步析出，达到粗分离蛋白质的目的。 胰凝乳蛋白酶的制备 实训试剂与设备 一、试剂和材料 1、新鲜猪胰脏 2、0.125mol/LH2SO4溶液 3、固体(NH4)2SO4 4、1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1.0g，加pH为8.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液100mL，在沸水中煮5min使之溶解，冰箱中保存。 5、磷酸盐缓冲液：0.1mol/L，pH为7.4 6、0.1mol/LNaOH溶液，1%BaCl2。 胰凝乳蛋白酶的制备 实训试剂与设备 二、实验器材 高速组织捣碎机，解剖刀，镊子，剪刀，烧杯（50mL、100mL），离心机，离心管，漏斗，纱布，棉线，吸管（10mL、5mL、2mL、1mL、0.5mL），玻璃棒，滴管，透析袋，台秤，分析天平，离心机。 胰凝乳蛋白酶的制备 生产实训 一、生产前准备 1、检查生产原料、各种生产用试剂； 2、检查生产设备； 3、检查生产记录等文件。 二、生产操作 1、胰凝乳蛋白酶提取：取新鲜猪胰脏，放在盛有冰冷0.125mol/L H2SO4的容器中，保存在冰箱中待用。去除胰脏表面的脂肪和结缔组织后称重。用组织捣碎机绞碎，然后混悬于2倍体积的冰冷0.125mol/L H2SO4溶液中，放冰箱内过夜。将上述混悬液离心10min，上层液经2层纱布过滤至烧杯中，将沉淀再混悬于等体积的冰冷的0.125mol/L H2SO4溶液中，再离心，将两次上层液合并，即为提取液。 胰凝乳蛋白酶的制备 生产实训 2、胰凝乳蛋白酶分离：取提取液10mL，加固体(NH4)2SO41.14g达0.2饱和度，放置10min，离心(3000r/min)10min。弃去沉淀，保留上清液。在上清液中加入固体(NH4)2SO41.323g达0.5饱和度，放置10min离心(3000r/min)10min。弃去上清液，保留沉淀。将沉淀溶解于3倍体积的水中，装入透析袋中，用pH为7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液透析，直至1%BaCl2检查无白色BaSO4沉淀产生，然后离心(3000r/min)5min。弃去沉淀(变性的酶蛋白)，保留上清液。在上清液中加(NH4)2SO4(0.39g/mL)达0.6饱和度，放置10min，离心(3000r/min)10min。弃去上清液，保留沉淀（即为胰凝乳蛋白酶）。 胰凝乳蛋白酶的制备 生产实训 3、胰凝乳蛋白酶结晶：取分离所得的胰凝乳蛋白酶溶于3倍体积的水中。然后加(NH4)2SO4(1.14g/mL)至胰凝乳蛋白酶溶液达0.25饱和度，用0.1mol/LNaOH调节至pH6.0，在室温(25～30℃)放置12h即可出现结晶。 胰凝乳蛋白酶的制备 产品检测 一、实验试剂与器材 N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（ATEE）、磷酸缓冲溶液 二、检测器材 试管、吸管、容量瓶、量筒、电子分析天平、比色皿、 722型分光光度计 。 胰凝乳蛋白酶的制备 产品检测 一、检测前准备 1、检测装运、各种检测用试剂； 2、检查检测记录等文件 二、产品检测 1、试样处理：取23.7mgN-乙酰-L-酪氨酸乙酯(ATEE)，加入0.067M磷酸缓冲溶液(pH值)50mL，温热使其溶解，冷却后用同一缓冲溶液稀释到100 mL。 2、