GST-pull-down试验方法(自己总结).pdfVIP

12.GST蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达 （1) 将表达 GST融合蛋白的质粒转入 BL21大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中， 37℃摇菌过夜，获得种子液。 （3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600为 0.1 。 （4) 28℃,220rpm 摇菌培养 2 小时。 （5) 加入 50 μl 100mM IPTG,16 ～27℃摇菌培养 1～8 小时。 （6) 收菌，将菌液倒入大离心管， 2 管/50ml 菌液， 4℃ 5krpmx5min 离心，弃 上清。 （7) 加入 10ml PBS/管，重悬细胞 ,5krpm 离心 5min，弃上清。 （8) 加入 2ml PBS/管，重悬细胞。转移至 5ml 离心管。 （9) 超声破壁 破壁前，在细胞悬液中加 20 μl 10mg/ml PMSF,80 μl 蛋白酶抑制剂 (100x) 。 破壁参数： Frequency:100 ～200w 60s， pause 20s run 40s,5cycles 破至菌 体由浑浊变为澄清。 加 100 μl 20% TritonX －100，冰上放置 30min。 （10) 将裂解液分入 1.5ml 离心管中， 4℃离心 12krpm×10min，取上清。 （11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮 3min 。离心 （12krpm,1min ），取上清作 SDS电泳，检测表达情况。 12.2 准备 50%GST Sepharose 4Bslurry （1) 将原 75%Glutathione Sepharose 4B 的 slurry 弹至混匀。 （2) 取 677 μl 原液/ 管， 3krpm 离心 5min，弃上清。 （3) 加 500 μl PBS，颠倒混匀， 3krpm 离心 5min，弃上清。反复 5 次。 （4) 加 500 μl PBS，颠倒混匀，配成 50%Glutathione Sepharose 4B 备用。 12.3 GST 融合蛋白的纯化 （1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入 20 μl 50%Glutathione Sepharose 4B， 4℃，摇床上摇，反应 30min～60min。 （2) 3krpm 离心 5min，弃上清。该 Sepahrose 上即结合了 GST融合蛋白， （如果 仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高， 可以只接合一次， 如果要结合更多 则接着往下做） （3) 在管中加入离心后的 1.5ml 新鲜制备的细胞裂解液的上清， 4℃，反应 30min～60min。3krpm 离心 5min，弃上清。重复该步骤多次， 就可以使 Sepahrose 上结合 6～ 10ml 裂解液中的 GST融合蛋白。 （4) 在管中加入预冷的 200 μl PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与 蛋白的联接） , 轻晃悬浮珠子，将 Sepharose 洗涤一次， 3krpm 离心 3min，弃上 清。 （5) 反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽 量吸净但不吸走珠子） ，即获得结合有 GST融合蛋白的 Sepharose。 （6) 如果用于检测，在 Sepharose 加入 15～20 μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，在 沸水浴中煮 3min 。12krpm 离心 1min，取上清作 SDS电泳。 （7) 如果用于 pull －down测试，参见 pull －down 步骤。 14. 体外蛋白质结合分析（ GST-pull down ） （1) 将结合有 GST融合蛋白的 Glutathione Sepharose 4B 悬浮在 500 μlN