原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
1.于Eppendorf 离心管中加入 10×PCR缓冲液 5μl(1×) MgCl2 2～10μl(1～5mM) 引物 适量(0.1～1μM) 标记/非标记dNTP 5μl (200μM，dTTP:Dig-dUTP=3:1) ddH2O 加到50μl 模板DNA 1～100ng Tag DNA多聚酶 0.2～1μl(1～5units) 步骤 PCR扩增标记法 反应组 对照组1 对照组2 DNA模板 + + - Dig-dUTP + - - 2．混合后PCR仪扩增 循环 温度 时间 1 94°C 5’ 94°C 45’ 2～31 55＋0.2°C 45’ 72°C 90’ 32 72°C 5’ 33 4°C Hold 步骤 PCR扩增标记法 杂交组织化学-探针 末端标记法：用于短链DNA或寡核苷酸探针标记 40个以上碱基检测较稳定 敏感性较低 分3端标记法和5端标记法 3 端标记法： 原理：DIG-11-ddUTP在末端脱氧核苷酸转移酶作用下 与寡核苷酸的3端相连 杂交组织化学-探针 5端标记法： 原理：寡核苷酸5端少一个磷酸基，T4噬菌体多核 苷酸激酶将[γ-32P]ATP的γ-32 P转移到5端 杂交组织化学-探针 RNA体外合成/标记法： 用以合成并同时标记RNA探针 产量高，NTP浓度要求低， 不用纯化 原理： 将模板DNA(双链) 插入带有噬菌体RNA pol启动子的特定质粒，在体外RNA多聚酶的作用下，以DNA为模板、启动子为起点， 合成带有标记核苷酸的RNA探针。 杂交组织化学-探针 RNA体外合成/标记法 pGEM 1.??? 于Eppendorf离心管中加入 DNA模板(酶切成线性) 1μg 含噬菌体启动子的质粒 NTP标记混合物 2μl 含10mM ATP， 10mM CTP 10mM GTP，6.5mM UTP 3.5mM DIG-11-UTP 10×反应缓冲液 2μl DEPC处理的H2O 加至 17μl RNA体外合成/标记法 步骤 2.混合后加：RNase抑制剂 1μl RNA多聚酶(SP6/T7) 2μl ?3.柔和混合后37℃保温2h ?4.加入DNase Ⅰ2μl，37℃15(去除模板DNA) ? 5.加入2μl 200mM pH8.0 EDTA ? 6.加入2.5μl 4M LiCl和75μl预冷乙醇 ? 7.混合后置-70℃，30或-20℃过夜 ? 8.4℃13000g离心15，弃上清 ? 9.加100μl 70%乙醇(预冷)洗，离心弃上清 ? 10.真空干燥，加100μl DEPC-H2O溶解，-20℃保存 RNA体外合成/标记法 步骤 杂交组织化学-探针 化学修饰法：常用的有光敏生物素、磺化 可用以标记单/双链DNA或RNA 光敏生物素标记：光敏生物素(叠氮基团)+核酸───标记探针 磺化标记：亚硫酸氢钠和甲
文档评论（0）