干扰素调节因子7（IRF7）基因在抗鸡ALV-J作用的研究.pdfVIP

摘要 J 亚型禽白血病（ALV-J ）作为传染性疾病，给家禽业造成了巨大的经济损 失。开展对 ALV-J 抗性相关基因的研究，是在基因水平进行抗病育种研究的基 础和关键。本研究建立在前期利用转录组测序技术筛选出的鸡 ALV-J 感染前后 差异表达数据基础之上，通过联合分析和宿主与病毒互作分析，获得了6 个可能 的抗病基因，其中干扰素调节因子7 （IRF7 ）的表达差异最大。因此，本研究以 IRF7 为目标基因，从以下几个方面探究其在鸡上抗ALV-J 过程中的作用。首先， 我们通过ALV-J 攻毒试验，检测IRF7 及其相关基因在机体抵御ALV-J 过程中 的表达变化，并辅助组织切片HE 染色方法观察 ALV-J 感染前后免疫组织的形 态病理变化。然后，以鸡胚成纤维细胞为细胞模型，检测IRF7 在细胞ALV-J 感 染和polyI:C 转染过程中的表达变化，并结合干扰和过表达技术，在细胞水平探 究IRF7 在抗ALV-J 免疫过程中的分子机制。通过上述一系列试验，我们得出以 下结果： （1）SPF 鸡经ALV-J 攻毒处理后，本研究选取了15、24 和40 日龄的胸腺、 肝脏和法氏囊3 个免疫组织进行了HE 染色。结果发现：感染ALV-J 前后，3 个 免疫组织在形态上有显著差异；其中，在15d 胸腺和法氏囊组织有明显病理差异 表现为有轻微脂肪浸润，并伴有少量淤血，肝脏组织无明显差异；在24d 和40d 胸腺、肝脏和法氏囊均存在明显病理学变化：胸腺含有大量脂肪组织，并有明显 疏松肿胀，髓质区也表现出扩张的状态。肝细胞排列紊乱，脂肪浸染相对较多， 肝细胞中部分细胞核固缩、凋亡。法氏囊被大量脂肪浸润，形成空泡状，囊小结 结构混乱，小结组织疏松肿胀。上述结果表明个体攻毒试验成功。 （2 ）采用Real-time PCR 技术检测了IRF7 基因在 15、24 和40 日龄脾脏、 胸腺、肝脏和法氏囊组织中的表达情况。结果发现，IRF7 基因在感染ALV-J 组 中表达量均显著高于对照组（P0.05 ），其相关基因IFN-α、IFN-β、IRF1 、STAT1 、 MyD88 、TLR3 和TLR7 在不同免疫组织中均有升高趋势，表明IRF7 及其相关基 因均参与机体抗ALV-J 反应。 （3 ）以鸡胚成纤维细胞为细胞模型，进行ALV-J 的感染和polyI :C 转染试 验，结果发现IRF7 基因在ALV-J 攻毒后，整体呈现先上升高后降低的趋势，且 IRF7 基因表达量均高于对照组（0h ）；相关基因在攻毒后，整体均表现出先升 I 高后降低的趋势，表达量均高于0h。polyI:C 转染后，IRF7 及其相关基因均呈现 先升高后降低的变化趋势。Western-blot 结果得出，选取ALV-J 和polyI :C 处理 后0h、24h 、48h 和72h 定量，IRF7 蛋白丰度先升高后降低，且都在48h 时达到 最高水平。由以上试验可知，在成纤维细胞上ALV-J 感染后，IRF7 及其相关基 因都参与了抗ALV-J 反应。 （4 ）在鸡胚成纤维细胞上进行IRF7 的干扰试验，处理组与对照组相比，IRF7 基因表达量在干扰后24h 和48h 均显著下降（P0.05 ），IRF1 、IFN-β、IFN-α、 STAT1 基因的表达量相对于对照组下调，而MyD88 、TLR3、TLR7 相比于对照组 上调。随后进行IRF7 的过表达试验，处理组与对照组相比，IRF7 基因表达量在 过表达后 24h 和 48h 都极显著升高（P0.0 1），IRF1 、IFN-β、IFN-α、STAT1 、 MyD88 和TLR3 上调，TLR7 下调。此试验结果揭示IRF7 对IRF1 、IFN-β、IFN-α、 STAT1 均有正调控作用。 （5 ）在鸡胚成纤维细胞中对IRF7 质粒DNA 进行过表达试验，24 h 后收取 部分样品Real-time PCR 定量检测确保过表达成功，随后再进行ALV-J 和polyI :C 处理24 h 后收取细胞样。在ALV-J 攻毒组和未ALV-J 攻毒组细胞中，与阴性对 照组（NC ）相比，过表达组中的IRF7 基因的表达量均极显著升高（P0.01 ）； 在polyI :C 转