WSSV的分离鉴定及3种结构蛋白对克氏原螯虾相关非特异性免疫因子的影响.pdfVIP

摘要 白斑综合征（White Spot Syndrome,WSS ）给全世界范围内的虾蟹类养殖业带来 了重大的危害。WSS 主要症状表现为头胸甲出现白斑，在临床症状出现10 天内感染 虾会全部死亡。20 世纪90 年代在我国台湾地区首次被报道，至今WSS 席卷全球， 给全世界范围的虾类养殖业带来了无法预计的损失。白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）感染虾类发病后没有特效药物可以进行有效控制，防治方法 主要以预防为主。本试验从湖北潜江自然发病的克氏原螯虾(Procambarus clarkii) 中分 离到WSSV ，并克隆相关结构蛋白VP28 、VP24 、VP466 基因构建重组真核表达质粒， 并研究其对克氏原螯虾相关非特异性免疫因子的影响。 发病克氏原螯虾临床症状主要表现为摄食减少，活力下降，反应迟钝；肝胰腺、 肠、肌肉、鳃组织均出现以细胞核肿大，细胞坏死为特征的病理学变化；PCR 检测 结果显示，患病克氏原螯虾WSSV 阳性检出率为56 ％；检测产物测序并进行系统发 育树分析，结果显示该基因序列与WSSV 的EG3 株(KR083866.1)核苷酸序列同源性 为 100%。人工感染螯虾的累积死亡率为 100%，并出现与自然发病虾相同的症状。 巢式PCR 检测结果显示，人工感染病虾为WSSV 阳性。本研究对湖北潜江地区自然 发病的克氏原螯虾进行临床症状观察、PCR 检测、系统发育树分析、人工感染和组 织病理学观察，鉴定出导致克氏原螯虾大规模死亡的病原是WSSV 。 VP24,VP28,VP466 蛋白含量在WSSV 均较高，为主要的抗原蛋白，是作为WSSV 免疫防治研究的重要候选蛋白。WSSV 的DNA 分子为双链环状，依照Genbank 上公 布的基因序列进行引物设计。将目的基因与T 载连接，再连接pEGFP-N1 真核表达质 粒构建重组质粒。按照 50μg/尾螯剂量，在螯虾腹部肌肉进行注射免疫，并设置 pEGFP-N1 组和 PBS 组。重组质粒 pEGFP- N1-VP24 、pEGFP- N1-VP28 、pEGFP- N1-VP466 免疫螯虾后 12d，在螯虾肌肉、肝胰腺、鳃、肠、胃组织中均能检测到目 的基因的存在，表明各组重组真核表达质粒广泛分布在螯虾各组织中。且转染结果显 -3.1 - 1 示，重组真核表达质粒能在FHM 中进行表达。免疫后7d 以10 ．mL 种毒液按0.1ml/ 尾的剂量于螯虾腹节肌肉进行注射攻毒，pEGFP- N1-VP24 组、pEGFP- N1-VP28 组、 pEGFP- N1-VP466 组的的相对保护率分别为 31.57 ％、42.11 ％、26.32 ％。于免疫后 0h、48h 、72h、168h、336h 采集各组螯虾的肝胰腺和肌肉组织，检测螯虾非特异性 I 免疫指标。pEGFP-N1-VP28 组、pEGFP-N1-VP24 组、pEGFP-N1-VP466 组螯虾体内 SOD 活力在免疫48h 后开始升高，72h 体内SOD 活性达到最高。各质粒组螯虾体内 PO 活力在72h 和168h 体内活性均较高，与对照组螯虾体内PO 活性值有显著性差异。 pEGFP-N1-VP28 组螯虾在48h 至336h，体内POD 活性均较高与对照组螯虾体内POD 活性值有显著性差异。结合攻毒实验的免疫保护率结果及SOD、PO、POD 的变化情 况显示 WSSV 相关结构蛋白 VP24 、VP28 、VP466 基因构建的质粒能提升螯虾非特 异免疫水平，且能降低克氏原螯虾感染WSSV 后的死亡率。 关键词：克氏原螯虾; 白斑综合征;分离鉴定;结构蛋白;非特异性免疫 II Abstract