枯草杆菌原生质体融合育种.doc

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枯草杆菌1和枯草杆菌2的 原生质体融合育种 细菌原生质体融合育种总述: 原生质体融合是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍——细胞壁,制成由原生质膜包被的裸细胞,然后用物理、化学或生物学方法,诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合,经染色体交换、重组而达到杂交的目的,经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。近年来,该技术已成为生物界颇受瞩目的研究领域,是细胞生物学中迅速发展的方向之一。Fodor和Schaeffer于1976年分别报道了巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种内原生质体融合,微生物原生质体融合现象得到证实,并建立了相应的实验体系。从此,原生质体融合育种广泛应用于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌,并从株内、株间发展到种内、种间,打破种属间亲缘关系,实现跨界融合。 枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌,革兰氏阳性菌细胞壁组成是肽聚糖、磷壁酸和一些多糖蛋白质。肽聚糖的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1,4糖苷键交替连接而成。溶菌酶和青霉素对细菌细胞壁都有一定的降解作用,溶菌酶是作用于细菌细胞壁肽聚糖主链的β-1,4糖苷键上;而青霉素的作用机制是竞争性地与转肽酶结合,阻碍了侧链的交联,作用在代谢时发生,因此必须在细菌生长分裂时期才有效。 细菌原生质体融合育种程序一般是: 菌株选择和遗传标记 原生质体制备和再生 原生质体融合 融合体再生与检出 重组子分离和遗传分析 枯草芽孢杆菌融合育种的重要意义 枯草芽孢杆菌是一种常见的有益菌,它可以净化水质,分解许多种有机质,通过融合育种可以将枯草芽孢杆菌1、2两个亲本的优良性状集中体现在融合细胞中,具有重要的遗传学意义。 通过筛选成功融合并能稳定遗传的工程菌投入生产,将产生巨大的经济效益和社会效益。 三、枯草芽孢杆菌原生质体融合育种具体步骤 (一) 培养基和溶液 1、常用培养基 (1)CM培养基(%):牛肉膏0.5,蛋白胨1,葡萄糖0.5,酵母膏0.5,NaCl 0.5,pH 7.2。 (2) DM3培养基:1mol/L琥珀酸钠500ml, 5%水解酪蛋白100ml, 10%酵母膏50ml,3.5% K2HPO4和1.5% KH2PO4100ml, 20%葡萄糖25ml,1mol/LMgSO420ml,2%牛血清蛋白5ml,4%琼脂200ml。 (3完全再生培养基:CM培养基中加入高渗溶液。 2、高渗溶液 DF溶液(mol/L):蔗糖0.25,琥珀酸钠0.25,EDTA 0.001,K2HPO4 0.02,KH2PO4 0.11,MgCl2·6H2O 0.01,pH 7.0。 SSM溶液(mol/L): 蔗糖0.5,顺丁烯二酸0.02,MgCl2·6H2O 0.02,pH 6.5。 HM溶液(%):NH4Cl 0.1, Tris 1.2, KCl 0.0035, NaCl 0.0058, Na2SO4·10H2O 0.03, MgCl2·5H2O 0.01, pH7.0。 (二)枯草芽孢杆菌原生质体的制备 1、培养枯草芽孢杆菌 取亲本菌株枯草芽孢杆菌1、2新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中,36℃振荡培养14 h,各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中,36℃振荡培养 3 h,使细胞生长进入对数前期,各加入25 u/mL 青霉素,使其终浓度为0.3 u/mL,继续振荡培养2 h。 2、收集细胞 各取菌液10 mL,4000 r/min 离心10 min,弃上清液,将菌体悬浮于磷酸缓冲液中,离心。如此洗涤两次,将菌体悬浮10 mL SMM 中,每mL 约含108~109 活菌为宜。 3、总菌数测定 各取菌液0.5 mL,用生理盐水稀释,取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基,36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。 4、脱壁 两株亲本菌株各取5 mL 菌悬液,加入5 mL 溶菌酶溶液,溶菌酶浓度为100 ug/mL,混匀后于36℃水浴保温处理30 min,定时取样,镜检观察原生质体形成情况,当95%以上细胞变成球状原生质体时,用4000 r/min 离心10 min,弃上清液,用高渗缓冲液洗涤除酶,然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。 5、剩余菌数测定 取0.5 mL 上述原生质体悬液,用无菌水稀释,使原生质体裂解死亡,取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL,涂布于完全培养基平板上,36℃培养24~48 h,生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。 计算酶处理后剩余细胞数,并分别计算二

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