raw264.7小鼠巨噬细胞protocol.pdf

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RAW264.7 细胞株的相关信息 ATCC: 美国模式培养物集存库 (American type culture collection)的简写 收到冷冻管细胞的处理方式 1. 收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形, 若有请立即通知。细胞株请 尽速开始培养,或立即冷冻保存 (置于 –70℃,隔夜后,移到液氮)。 2. 收到 T25 flask 细胞的处理方式 于寄送过程中,为避免起泡造成细胞脱落死亡,T25 flask 均加满培养基。 2.1. 检查 flask 外观,并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象,若有任何问题, 不要打开盖子,请立即通知细胞实验室。 2.2. 将原封之 T25 flask 静置于 37℃, 5% CO2 培养箱中,使细胞回温至 37℃,并让运 送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。 2.3. 隔天后,于无菌操作箱内取出 flask 内之培养基,(取出之培养基可以再使用),仅留 约 5-10ml 培养基于 flask 内,依一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘, 则将细胞做传代培养。 RAW264.7 细胞株的 Cell Culture 一、RAW264.7 细胞培养的特点 1、RAW264.7 细胞一般为圆形或椭圆形,功能活跃时,可呈多突形。细胞核为圆形或椭圆形, 染色较深。贴壁特别牢固。 2、RAW264.7 具有很强的吞噬能力,当吞噬抗原后,细胞会释放趋化因子,进一步促进细胞 伸出伪足,增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、 长梭形,镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。 3、每次传代都很难消化下来。用力过大则对细胞损伤较大,这种细胞传代时接种密度要大, 否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化,细胞变成长形,并且不能回复,这是培养这种细胞时 最需要注意的问题。 4、对于 RAW264.7 细胞他的声场时喜欢结伴。正常生长状态应该是一小片一小片的生长,片 片之间不连接,等到长到更多更密的时候会连成大片,并且会叠加成层。所以,要很好地控 制好细胞的生长速度,不要等到叠加成层的时候再传代。 5、RAW264.7 细胞传代后贴壁时间较短,半小时就能贴很多,刚贴壁是细胞呈圆形,折光 度很好,镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后,部分细胞会变成类 似四角形,伸出伪足之类的。这个时候就是提醒你注意传代了,这部分细胞如再不传代,很 容易就老化掉。 二、RAW264.7 细胞传代 1) 将培养瓶内旧的培养液弃掉, 然后用 D-Hanks 液洗两次,(一定要洗干净,以免影响胰酶 的消化作用) 2) 加入 0.25%胰酶-EDTA 消化,25cm 培养瓶加 0.4ml, 37 度消化 5min,镜下看到细胞变圆, 间隙增大。(值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感) 3)立即加含 10%FCS 的培养液终止消化,用细胞刮刀轻刮,注意,这时候用吸管吹不下来, 但是刮刀却很容易刮下来,而且对细胞的损伤极小 4)离心,弃上清,加新的培养液(10%FCS),小心吹匀,分装入新的培养瓶 三、RAW264.7 细胞冻存及复苏 (一)细胞冻存 1. 配制冻存培养液;(通用的为培养基:血清:DMSO=7:2:1,但其中的血清可进行 调整,如上面的仁兄用的 4:5:1,比例过高) 2. 取对数生长期的细胞(冻存前一天换液),用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来, 悬浮生长的细胞则直接将细胞移至 15ml 离心管中; 3. 离心 1000rpm,5min; 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细 胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为 5×106/ml~1×107/ml; 5. 将细胞分装入冻存管中,每管 1~1.5 ml (不超过冻存管容量的80%); 6. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者; 7. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至 -5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃ 冰箱 2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。(具体操作为 4°C 20min,-20°C30min,-70℃过夜,转入液氮中) (二)细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入 37℃温水中,并不时摇动令其

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