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CRISPR_Cas9_基因编辑技术简介 1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。 2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats). 2013年之后，研究者们在《science 》和《nature》等国际著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。 1.CRISPR/Cas系统概述 已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至少存在CRISPR?基因座。 根据Cas 基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas 免疫体统分为3中类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas9免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链，目前Ⅱ型系统是被改造的最成功的人工核酸内切酶。 1.CRISPR/Cas系统概述 1.1CRISPR的分布与分类： CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。 1.2CRISPR系统获得： 1.CRISPR/Cas系统概述 2.CRISPR/Cas系统结构 2.1CRISPR/Cas 主要由两部分组成： 2.2CRISPR结构： CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列(spacer)与靶基因进行识别。 2.CRISPR/Cas系统结构 2.3Cas家族： Cas(CRISPR associated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA 引导下对靶位点进行切割。它与fokI酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。 2.CRISPR/Cas系统结构 CRISPR基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工） 当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步加工成小的成熟的crRNA. CRISPR/Cas系统活性的发挥或外源遗传物质的干扰 crRNA结合相关的Cas蛋白后，形成crRNA-Cas蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas蛋白对目标DNA 进行断裂和降解。 3.CRISPR/Cas9系统作用机制 4.CRISPR/Cas9系统 Type Ⅱ 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。 Type II系统具有以下特点： 在CRISPR/Cas基因座上游会表达tracrRNA; tracrRNA会参与crRNA的加工，这个工程亦需要RNaseIII的参与； tracrRNA会与crRNA形成二聚体指导Cas对双链DNA的切割。 Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和HNH两个内切酶活性中心 Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。 4.CRISPR/Cas9系统 Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明,这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA) 4.CRISPR/Cas9系统 4.CRISPR/Cas9系统 酿脓链球菌 4.CRISPR/Cas9系统 CRISPR Design Tool: / E-CRISPR: ZiFiT: / Cas9 Design: http://cas9 ./index.jsp Cas-OFFinder: /cas-offinder/ CCTop: http://crispr.cos.uni-heid