染色体显微操作1.ppt

; ;显微切割技术是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织,细胞群，细胞，细胞内组分或染色体区带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术。 显微切割技术实际上属于在微观领域对研究材料的分离收集技术，因此应用此技术往往是许多要深入的研究工作中起始的重要一步。 ;显微切割的特点 一是“细微”，显微切割的对象可以达到微米级，显微切割的精度可以达到毫微米级，因此利用显微切割技术可以分离收集到象核仁和染色体特异区带这样细微的对象； 二???“原位”，利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。 三是“同质”，显微切割技术可以保证所取材料一定层次上的同质性。 四是“结合”，显微切割技术可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。;显微切割的结合技术 能与多种分子生物学、免疫学、遗传学及病理学技术结合应用，使显微切割技术显示出蓬勃的生命力。 根据研究的需要可在显微切割前应用组织化学、免疫组织化学、原位杂交、原位末端标记、原位PCR、FISH、组织特染等方法对需要切割的组织内成分进行标记。 显微切割后获得的材料可以用于提取蛋白质、DNA和RNA等用于Western Blot、Southern Blot、Northern Blot、PCR等蛋白质和核酸的相关分析。;显微切割的影响因素 最终结果的因素多种多样。 在实验过程中把握一个原则,即一切与显微切割结合的技术中影响因素应同时列为显微切割实验最终结果的影响因素，在实验的过程中予以考虑。 与不同的方法结合决定了需要对显微切割的材料进行不同的处理。; 染色体显微切割技术出现于20世纪80年代。Scalenghe等（1981）首次报道了应用特殊玻璃针对果蝇唾液腺染色体进行切割、分离和显微克隆。因为当时尚没有发明PCR技术，需分离数百条染色体才可获得足够数量的DNA。 PCR技术发明之后，Lüdecke等（1989）将PCR技术应用到染色体显微切割和克隆中，仅用少量切割片段就获得了足够数量的DNA。 自1989年以来，染色体的显微切割技术的研究成果主要是人类染色体区带特异探针池的构建，采用玻璃针法已相继构建了一系列人类染色体区带探针池。; 时至今日，植物染色体分离技术也已经发展成熟，并成为构建染色体特异区段DNA探针池最为有效和直接的技术手段，例如，应用显微切割技术可以获得长度为1～3Mb的DNA片段，相当于水稻基因组遗传图谱上1～3cM。 在理论上，遗传标记之间1cM的距离已连锁非常紧密。因此，应用染色体显微切割和分离技术建立特定染色体区段的DNA文库，已成为筛选与基因紧密连锁的分子标记和基因克隆的有效方法之一。 染色体显微切割的方法主要有5种：流式细胞分类器法、微细玻璃针法（手工操作法）、激光切割法、玻璃针-激光法和激光捕获微分离法。此外，目前开始尝试使用微操作机器人系统。;1、激光切割法 此法与手工操作法的主要差别在于：用激光束代替玻璃针，将染色体标本上不需要的片段剔除，然后将剩余染色体片段消化、扩增。Fukui等利用此法成功地切割了植物染色体片段，但是该方法对设备要求较高，激光切割区域对DNA分子也有损伤。;2、流式细胞分类器法： 流式细胞分类技术分析和分选染色体是分子生物学和遗传学研究的一个非常有效的方法。 1983年至1986年，美国的两个实验室用流式细胞分类器和分子生物学技术建立了人类24种染色体特异性的基因文库。也有学者利用此项技术分离了番茄第二号染色体。;优缺点 使实验过程机械化，可用于处理大批染色体。 但结构相似的染色体难以分开，使有些文库中其它染色体污染率高达10-50%，不能构建染色体区带特异性文库。 ;;3、玻璃针-激光法 由于激光显微切割法需要价格昂贵的特殊培养皿，操作也较复杂。且氩离子激光热效应大，容易对切口附近的染色体DNA造成较大损伤。 玻璃针法较为成功，但难以对染色体进行精确的定位切割。王槐等研究了一种由激光微束与玻璃针结合使用来切割分离植物染色体片段的方法。 ;优缺点 盖玻片的存在减少了切割过程中外源DNA分子的污染，且为油镜下更准确地识别目的染色体和定位切割靶点创造条件，切割准确； 因为用玻璃针分离切割后的染色体，所以用普通载玻片即可进行染色体制备，费用较低； 但仍需借助玻璃针的操作，易污染。;4、激光捕获微分离法 它是一种将紫外激光束切割与激光压力弹射相结合的新方法，激光聚焦点直径小于1um，是目前最为先进的技术，它使染色体显微切割操作步骤大大简化。 ;将超薄膜用胶带封固在干净的载片上，紫外消毒，染色体制片。 用激光脉冲将靠近目标染色体的不需要的遗传材料选择去除。 围绕目标染色体，用激光脉冲切割薄膜，通过激光压力弹射操作仪