分子标记辅助选择育种.pdf

分子标记辅助选择育种 传统的育种主要依赖于植株的表现型选择 (Phenotypieal selection)。环境条件、基因间互作、基因型与环境互 作等多种因素会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病的条件、 植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定 工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费 7～8 年甚至十几年时间。 如何提高选择效率，是育种工作的关键。 育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选 择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标 记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗 TMV 的矮黄标记、水稻的 紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。以非整倍 体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记， 在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴 定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。生化标记主要是 利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差 异。它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低， 且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传 育种工作需要。以 DNA 多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图 谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与 品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选 择 (molecular marker-as—sisted selection，MAS)育种更受到人们的 重视。 第一节 分子标记的类型和作用原理 一、分子标记的类型和特点 按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础 的DNA 标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记 (Restriction fragment length polymorphisms，RFLP 标记)；第二类是以聚合酶链式 反应 (Polymerase chain reaction，PCR 反应)为基础的各种 DNA 指纹技 术。PCR 是 Mullis 等 (1985)首创的在模板 DNA、引物和 4 种脱氧核糖核 苷酸存在的条件下，依赖于 DNA 聚合酶的体外酶促反应，合成特异 DNA 片段的一种方法。PCR 技术的特异性取决于引物与模板 DNA 的特异结合。 PCR 反应分变性 (denaturation)、复性(annealling)、延伸 (exten—sion)三步 (图 17—1)。变性指的是通过加热使DNA 双螺旋的氢 键断裂，双链解离形成单链 DNA 的过程；复性(又称退火)是指当温度降 低时，单链 DNA 回复形成双链的过程，由于模板分子结构较引物要复杂 得多，而且反应体系中引物 DNA 大大高于模板 DNA，容易使引物和其互 补的模板在局部形成杂交链；延伸是指在 DNA 聚合酶和 4 种脱氧核糖核 2+ 苷三磷酸底物及 Mg 存在的条件下，在聚合酶催化下进行以引物为起始 点的 5 '-3 '的DNA 链延伸。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以 作为下一个循环的模板，经 25～30 个循环后，介于两个引物之间的特 异 DNA 片段得到大量的复制，数量可达 2×106-7 拷贝。按照 PCR 所需引 物类型又可分为：①单引物 PCR 标记，其多态性来源于单个随机引物作 用下扩增产物长度或序列的变异，包括随机扩增多态性DNA 标记(Random 别 amplification polymorphism DNA，RAPD)、简单重复序列中间区域标 记 (1nter-simple sequence repeats polymorphisms，ISSR)等技术；② 双引物选择性扩增的 PCR 标记，主要通过引物 3'端碱基的变化获得多态 性，这种标记主要指扩增片段长度多态性标记(Amplified fragment lengthpolymorphisms，AFLP)；③需要通过克隆、测序来构建特殊双引 物的 PCR 标记如简单序列重复标记 (Simple sequence repeats，SSR)、 序列特征化扩增区域 (Segion，简称 SCAR 技术)和序标位 (Sequence—tagged sites，简称 STS)等。第三类是一些新型的分子标 记，如单核苷酸多态性 (Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基 因组核苷