《新一代测序技术的原理》.ppt

* * * * * * 2 Hiseq 2000（Solexa）测序原理 Solexa是一种基于边合成边测序技术(Sequencing-By-Synthesis，SBS)的新型测序方法。通过利用单分子阵列实现在小型芯片(Flow Cell)上进行桥式PCR反应。由于新的可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息。 可逆阻断技术 C T A G C T A 5’- 3’- …-5’ G T 合成第一个碱基 Cycle 1:按顺序加入反应试剂 清除未反应的碱基和试剂 激发碱基荧光并收集荧光信号 去除阻断基团和荧光基团 Cycle 2-n: 重复前面的步骤 G T C T A G T C T G C T A G A 基于SBS的Solexa测序技术 3 Hiseq 2000测序技术流程 制备芯片 模板杂交 桥式PCR扩增 测序引物准备测序 2 测序 测序生成 base calls 3 数据分析 拍照图片 Intensities Reads Alignments 4 DNA打断 末端修复 加A 加接头 纯化 文库制备 1 3.1 文库制备 Solexa有三种不同的测序种类： Single-Read Sequencing 单向测序 Paired-End Sequencing 双向测序 Indexed Sequencing 混合样品测序 这三种测序类型的文库构建大体一致，主要区别在于接头。 Single-Read Sequencing Fragment DNA 5’ 3’ 5’ + 3’ 5’ 5’ + 5’ 3’ 3’ 5’ 1.End repair T4 polymerase , DNA Pol 1 (Klenow fragment) 3’ 5’po4 po45’ 3’ Phosphorylation T4 polynucleaotide kinase, ATP 3.Ligation of adaptors 3’A po45’ A3’ 5’po4 2.Add 3’ Adenosine with Klenow (3’exo- ) and dATP + DNA insert 5’ 5’ 3’ 3’ SBS oligo P7 反向互补序列 3’T 5’po4 3’ 5’ SBS oligo P7反向互补序列 PCR enrichment 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 1st round PCR P7 P5 SBS oligo P7 反向互补序列 P7 3’ PCR enrichment (cont.) 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 2nd round PCR Insert P7 P5 SBS oligo P7 反向互补序列 P5 Cluster template SBS oligo P7 Paired-End Sequencing 双向测序 Indexed Sequencing 混合样品测序 3.2 芯片制备和测序 Cluster 生成步骤: 固定 扩增 线性化 阻断 引物杂交 Cluster 生成化学步骤 cBOT Flow Cell 想像图 进样孔 出样孔 Single-Read Sequencing(SR, 单向测序) OH Flow Cell接头 diol P7 P5 diol diol 模板杂交 diol diol 延长 diol diol 变性 碱基片段杂交固定 diol diol 1st cycle 变性 1st cycle 退火 diol diol 1st cycle 延长 diol diol diol diol 2nd cycle 变性 2nd cycle 退火 diol diol diol diol diol diol 2nd cycle 延长 n=35 总数 碱基片段扩增成簇 线性化 OH 用ddNTP (?) 阻断 Cluster 扩增完成 OH diol diol OH Cluster Station 结束 Primer 加测序引物 OH NaIO4 每一个基因簇就是信号收集照片上一个亮点 Y X 通过荧光信号读取序列信息 1 2 3 7 8 9 4 5 6 T T T T T T T G T … T G C T A C G A T … 通过荧光信号读取序列信息 3.3 测序 Paire