微生物菌种分离、驯化.docx

保罗微生物发酵饲料高效复合降解菌的分离、驯化 天然菌种的分离纯化 1.1 天然菌种的获得 取健康动物（猪、牛、羊）及水产品鱼虾的新鲜排泄物，分别投入生理盐水中制成菌悬液， 用稀释平板法进行分离。 分离培养时细菌用牛肉膏蛋白胨培养基， 37℃培养 1～2 天；放线菌用高氏一号培养 基，28℃培养 3～5 天；霉菌用查氏培养基， 28℃培养 3～4 天[ 1] 。在平板上分离得到的菌株中选择较大、健壮、饱满的菌落，采用平板划线法继续纯化，直到在线条较疏处出现单个菌落。 1.2 菌种初筛 由于饲料中含有大量的蛋白质、淀粉、纤维素等有机物质，这些是动物营养物的主要来源， 为了使动物有效利用饲料， 本实验从分纯所得菌中以能够高效降解蛋白质、淀粉、纤维素、木聚糖、葡聚糖、植酸、油脂的细菌、真菌菌株为目标菌株，利用菌的生理生化特性对分纯所得菌株进行初筛。 筛选时分别用淀粉水解培养基、明胶培养基、油脂水解培养基、 赫氏（ Dubos）纤维菌基础培养基、桑塔氏培养基、 BPY琼脂培养基、 YEPD固体培养基、 菌种驯化 2.1 分解发酵能力驯化 本实验采用在选择性培养基上测溶解圈的方式来驯化初筛所得优势菌群，以提高对饲料原料降解的能力和降解性能。 2.2 发酵饲料适口性驯化 同时对各菌种发酵产物的气味进行感官检定， 有恶臭、或其他不良气味的舍去。 2.3 食品营养学、毒理学驯化 采用异常毒性试验方法， 制品 2g 加入 8mL 灭菌生理氯化钠溶液中，用体重 18-22g 健康小鼠 5 只，每只经口灌胃 0.5mL，每天一次，连续 3 天。从第一天灌胃起，连续观察 7 天，小鼠应健康活存，体重增加，判为合格。如不符合上述规定，则该菌株舍弃。 复配菌种效果检测 3.1 产酶能力测定 将以上研究所得菌种分别测定在特定底物发酵过程中的产酶酶 活。确定各菌株产酶能力。 补充酶活测定方法（ GB？） 3.2 饲喂效果测定 将以上研究所得的高效复合降解菌参考国外微生物饲料淀粉酶、 蛋白酶、纤维素酶等的酶活比例投放到饲料中，饲料配方、每餐饲喂 量由畜牧专家提供。 具体饲喂情况见下表。 不同品种饲喂情况 4、结果与讨论 4.1 菌种分离结果 分纯共得到繁殖能力、降解能力、适应能力都较好的菌株细菌 137 株、真菌 63 株。 4.2 菌种初筛结果 将分纯所得菌株经过大量生理生化实验初筛得到： 可高效降解淀粉的细菌有 10 株，真菌 4 株；蛋白质降解菌中细菌有 9 株，真菌 6 株；油脂降解菌中细菌有 5 株，真菌 9 株；纤维素降解菌中细菌有 4 株，真菌 8 株； 最后共筛选出高效降解菌株有细菌 24 株，真菌 13 株。 4.3 菌种驯化结果 将初筛选所得的所有菌通过产酶能力、饲喂适口性、营养学、毒 理学驯化得细菌 20 株，真菌 12 株。选定生产用菌株细菌 5 株，真菌 株。其他菌株作为公司将来继续深入研究的资源菌株。 表2 高效降解菌株及形态特征（细菌） 菌株 菌株 菌落形态 革兰氏 编号 颜色 染色 X1 乳白 圆形，形大，表面湿润，粘性，半透明 — 色 X2 浅橙 圆形，形小，表面湿润，粘性，不透明 + 色 X3 土黄 圆形，形小，表面湿润，粘性，不透明 + 色 X4 白色 圆形，形较大，表面干燥，边缘皱起，粘性，不 + 透明 X5 乳白 圆形，形较大，表面湿润，不透明 — 色 日 X4 白色 圆形，形较大，表面干燥，不透明 — 日 X5 浅黄 圆形，形较大，表面干燥，边缘皱起，不透明 + 色 日 X6 无色 圆形，形小，表面湿润，透明 — 日 X10 白色 圆形，形较大，表面湿润，粘性，不透明 + 日 X22 黄白 圆形，形大，表面湿润，粘性，不透明 — 色 表3 高效降解菌株及形态特征（真菌） 菌株编 菌株颜 菌落形态 号 色 F3 灰色 圆形，形较小，干燥，不透明，表面有水珠 F8 浅橘色 圆形，形较小，干燥，不透明 F11 白色 圆形，形小，干燥，不透明 日 F23 浅灰色 圆形，形较小，干燥，不透明，表面有水珠 M1 深绿色 圆形，形大，干燥，表面毛绒状，菌落厚 M2 黄色 圆形，形很大，干燥，表面粉末状，有凹凸，菌落厚 M3 灰黑色 圆形，形很大，干燥，表面粉末状，菌落厚 M4 白色 不规则，长在其他菌落周围，干燥，菌落薄 日 M1 棕色 圆形，形大，干燥，表面粉末状，菌落厚 日 M4 棕黄色 圆形，形大，干燥，表面粉末状，菌落厚 日 M5 灰色 菌落不规则，成片生长，表面干燥，有很长丝毛状 日 M6 棕红色 圆形，形较大，干燥，表面粉末状，菌落厚 日 M8 砖红色 圆形，形较大，干燥，表面粉末状，菌落厚 日 M11 黑色 圆形，形大，干燥，表面毛绒状，菌落厚 注：革兰氏染色为阳性用“ +”表示，阴性用“—”表示。 根据菌落形态，及